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鸡肉蛋白酸水解制备短肽的研究

  2020-10-14    198  上传者:管理员

摘要:试验以鸡肉粉为原料,在80、90和100℃条件下经6mol/L盐酸水解2、3、4、5、6、7、8、9、10和12h,选出利用酸水解法制备短肽的适宜条件,并研究该条件下水解产物分子量的分布范围。结果表明,试验鸡肉的含氮量为14.36%。水解度50%时的适宜水解条件为温度90℃、反应时间4h,产物的分子量分布在5.5kDa左右。

  • 关键词:
  • 水解时间
  • 水解温度
  • 短肽
  • 酸水解
  • 饲料研究
  • 饲料资源开发
  • 鸡肉
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蛋白质的开发利用是饲料研究中的重要内容。将动物蛋白应用到饲料生产中具有良好的生产效率、社会效益及经济效益。从饲料安全层面分析,应用动物蛋白饲料资源需要考虑安全隐患问题[1]。水解肽在我国畜牧业中的研究与应用备受关注,已有大量研究集中于从肉类食品中开发生物活性肽[2]。而通过酸解法将畜牧副产品加工转化为短肽饲料将会降低安全隐患,减少资源浪费。研究表明,蛋白水解物中的不同分子量的短肽除具有营养作用外,还具有生物活性,这些肽以外部分子信号形式对细胞的代谢和增殖产生作用,有利于增强细胞活力和促进细胞生长[3]。王淑娴等[4]研究表明,将小肽作为饲料添加剂可有效提高刺参的非特异性免疫能力。畜禽肉水解后获得的动物蛋白(HAP)均为短肽和L型游离氨基酸,蛋白水解液中的肽可以使其拥有一定的风味,不同风味特性与水解程度和肽链结构有关[5,6]。刘娜等[7]研究发现,通过纤维蛋白酶解鸡肉肌原得到的产物具有清除DHPP能力,其清除率可达84.70%。目前,酸水解法、碱水解法和酶水解法是水解鸡肉蛋白的常用方法。酸水解法是利用盐酸在一定温度条件下水解,可将蛋白转化为短肽。水解过程具有卫生安全、低成本性的优点。参数筛选出来,可以进行规模生产。但是,水解蛋白时的温度、盐酸的浓度和水解时间因蛋白种类的不同需要探讨。本试验利用鸡肉副产品作为原料进行水解,为饲料资源的开发及工业化规模生产提供参考。


1、材料与方法


1.1试验材料

鸡肉副产品来自黑龙江八一农垦大学动物科技学院饲养的三黄鸡。

1.2试验试剂

溶液Ⅰ:6mol/LHCl;溶液Ⅱ:0.01mol/LNaOH标准溶液,以邻苯二甲酸氢钾标定;溶液Ⅲ:中性甲醛溶液,在100mL的烧杯中倒入50mL的甲醛,用0.01mol/LNaOH滴定至中性;溶液Ⅳ:保存液25mL甘油,用蒸馏水稀释到250mL。

1.3试验仪器

梅特勒-托利多DELTA-320-PH计(北京东南仪诚实验室设备有限公司)、电热恒温鼓风干燥箱(上海森信实验仪器有限公司)、D2G-6090真空干燥箱(上海森信实验仪器有限公司)、电热恒温水浴锅(上海森信实验仪器有限公司)、电子分析天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)、TGL-16G离心机(上海安亭科学仪器厂)、旋转蒸发器(上海安亭科学仪器厂)、DYY-5电泳仪(PowerPacBasic公司)、电泳槽(北京六一仪器厂)、微量移液器(上海大龙仪器有限公司)、水平摇床(北京六一仪器厂)。

1.4试验设计

采用两因素3×10试验设计,将适量鸡肉溶于6mol/LHCl后,设计3个温度80、90、100℃,在3个不同温度条件下鸡肉水解2、3、4、5、6、7、8、9、10和12h(见表1),以水解度达50%左右为判断依据,确定酸水解的适宜条件;并利用SDS-PAGE对最适温度下的水解产物分子量的分布范围进行探究。

表1水解的温度与时间设计

1.5试验方法

1.5.1样品制备

鸡肉预处理:鸡肉副产品在常温条件下解冻,绞碎后进行干燥恒重(干燥温度60℃),干燥后粉碎过100目筛,制成鸡肉粉。鸡肉粉通过添加石油醚的方法进行脱脂[8]。具体步骤为:把沸程在30~60℃的石油醚和鸡肉粉混合,比例为4∶1,在20℃左右充分搅拌1h,在4℃条件下静止0.5h,回收石油醚作为废液处理,此过程重3次。在温度为65℃的鼓风干燥箱里驱除残留石油醚,即得脱脂鸡肉蛋白粉。准确称取35mg的样品于已标号的消化管中,加入10mL6mol/L的盐酸,经N2洗涤30s后封管,置于电热恒温鼓风干燥箱中,分别在80、90、100℃水解2、3、4、5、6、7、8、9、10、12h。到达反应时间后,将消化管取出,打开盖子,迅速置于高速真空干燥箱中挥发盐酸。挥酸后的水解液3000r/min离心10min,保留上清液。

1.5.2水解度的测定

(1)采用中性甲醛电位滴定法[9]测定游离氨基氮含量:烧杯中加入1mL水解液,添加不含CO2的蒸馏水2mL,用0.01mol/L的NaOH将pH值调节为8.2,添加中性甲醛溶液1mL,充分混匀静置10min。蛋白水解液用0.01mol/L的NaOH标准溶液滴定至pH值9.2,记录所用NaOH标准溶液的体积,用于计算其游离氨基氮的含量(mmol/L)。

(2)清液中的总氮量测定:称取0.03g鸡肉于消化管中,加1勺催化剂混合均匀,同时添加10mL硫酸,消煮炉预热1h,预热时温度不可太高。样品反应不在产生泡沫时,加热温度调至410℃,消煮管中的溶液变澄清后再加热15min。每个试样要一个空白样,在空白消化管中添加20mg蔗糖,其余代替样品。消化好的样品转移到100mL容量瓶中定容。样品总氮含量采用凯氏定氮法测定[10]。蛋白质水解度公式[11]如下:

公式1

1.5.3水解产物分子量的测定

本试验采用SDS-PAGE电泳银染法测定水解产物的分子量,以水解度达50%左右为判断依据,选择合适温度和水解时间内的水解物进行电泳[12]。试验中配置15%的分离胶和5%的浓缩胶,SDS-PAGE凝胶配方见表2。

表2SDS-PAGE凝胶配方

1.5.3.1样品的准备

将挥酸完毕的水解液置于旋转蒸发器中,在60℃水浴下蒸干,用蒸馏水重复洗涤3次,蛋白质样品与上样缓冲液混合均匀,分别以40℃水浴0.5h、60℃水浴10min和沸水中煮2min处理。

1.5.3.2制板、安装与跑样

(a)1.5mm制胶板的安装

将玻璃内槽(带磨砂边缘的为大玻璃片)和短玻璃片清洗干净,将玻璃板放在65℃烘干箱中烘干,待两块玻璃板都干燥后将短玻璃板置于玻璃内槽内侧(磨砂面的一侧),将两块玻璃板组装好后用力将两块玻璃板按压在密封条上,并将槽内的两端边缘封死避免液体发生侧漏。

(b)配制分离胶

在离心管中加入双蒸水、49.5%T3%C和凝胶缓冲液混合均匀。将10%PAGE胶凝固剂和PAGE胶促凝剂加入离心管中,迅速混合均匀倒入凝胶模具中,在分离胶溶液上轻轻覆盖1~3cm的水层,使凝胶表面保持平整静置,待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面表示凝胶已聚合。

(c)配制浓缩胶

滤纸将残留的水吸去。在离心管中先加入双蒸水、49.5%T3%C和凝胶缓冲液然后混合均匀。将10%PAGE胶凝固剂和PAGE胶促凝剂加入离心管中,迅速混合均匀倒入凝胶模具中,将梳子插入凝胶内,聚合后,拔梳子时应小心,防止加样孔被破坏。

(d)点样、跑样与染色

将电泳槽放入4℃或冰水浴中,外槽加入阳极缓冲液(T1225),内槽加入阴极缓冲液(T121),30V预电泳10min,将样品(已经过Tricine专用上样缓冲液P1325处理)加入点样孔后30V电泳1h,100V电泳至溴酚蓝到达胶底部后停止电泳。电泳后取出凝胶,浓缩胶切除,将分离胶在固定液中浸泡30min,银染法染色30min,蒸馏水洗3次,甲醛显色2~15min,最后把蛋白胶放到蛋白凝胶成像系统中照相。

1.6数据统计与分析

试验数据结果以“平均值±标准差”表示,采用Excel对数据进行初步处理,SPSS22统计软件对数据进行回归分析,建立80、90、100℃条件下的水解时间对水解度的回归方程[13,14]。


2、结果与分析


2.1鸡肉蛋白氮含量结果

通过凯式定氮法测得此试验鸡肉的含氮量为14.36%。

2.2时间和温度对酸水解鸡肉蛋白的水解度的影响

2.2.1时间对鸡肉蛋白水解度的影响(见表3)

由表3可知,反应开始时,体系中底物充足时使大分子蛋白质含量迅速增加;之后大分子肽段裂解成更小的肽段和游离氨基酸。2~10h内水解度增加较快;4~8h内水解度上升缓慢。2~4h内增加速度较慢,10~12h内酸解时虽然鸡肉水解度有所增加,但比较缓慢。

表3温度和时间对鸡肉蛋白水解度的影响

2.2.2温度对鸡肉蛋白对水解度的影响(见表3)

由表3可知,当酸水解温度为90℃和100℃时只需4h水解度分别达到了49.54%和50.02%,而水解温度为80℃、4h时水解度仅仅达到46.32%,与前两个温度相比水解速度慢,从整体看温度越高酸水解速度就越快。

2.2.3酸水解的水解度与时间和温度的回归分析(见表4)

由表4可知,水解度与水解时间和温度存在极显著正相关关系(P<0.01)。反应温度相同,水解度随水解时间延长而增加。时间增加,水解度增加并不明显;考虑水解时间过长会增加能耗,增大生产成本,因此不再对时间大于12h的情况进行补充试验。由于90℃与100℃条件下水解度随着时间增加的变化不显著,考虑温度越高对肽键的破坏程度就会越严重,可能会导致短肽的性能消失以及能耗和成本增加。因此,本试验确定90℃为酸水解的适宜温度;根据此条件下拟合度最好的对数(log)曲线方程,确定4h为水解度达到50%的水解时间。

2.3水解产物蛋白SDS-PAGE结果分析(见图1)

由图1可知,90℃条件下水解2h,可看到相应的模糊条带,可分别得到20kDa和5.5kDa的肽,说明90℃水解2h可以获得短肽。同时,在同样的HCl浓度和温度条件下,水解3或4h,也能见到大约为5.5kDa的肽,超过这个分子量的蛋白比较少,而在5~12h之间的水解已看不到小分子的肽,未见明显条带。

表4酸水解的水解度随时间的回归方程

图1酸水解鸡肉蛋白多肽SDS-PAGE分析


3、讨论


试验主要研究温度和时间对鸡肉水解度的影响,酸水解鸡肉蛋白游离氨基酸与总酸的比值约为0.9。酸水解鸡肉时需要高温,有较好的杀菌效果,具有保存时间延长、生产周期短及提高生产力等优点[15]。研究表明,利用酸水解法水解蛋白质检测到水解液中有大量的氨基酸和短肽[16],蛋白质水解度越大水解液中含氨基酸就会越多,而生物活性和其功能都会得到提升[17]。因此,想要得到目的肽段需要根据固定的水解度来达到。本研究中采用酸水解的方法来水解鸡肉制备短肽,发现水解率在36.82%~50%内可以得到5.5kDa的短肽。在90℃水解5~12h,水解度缓慢上升,水解率超过50%的短肽很少,是因为蛋白多已水解成氨基酸。本试验结果表明,通过方程模拟在水解温度为90℃时,水解时间2~5h,水解度就可以达到50%,通过检测可以看到5.5kDa的肽进一步验证这一观点。推测在80℃时,水解不超过6h也可以达到此效果,100℃水解不到4h也可以达到效果。Bezerra等[18]采用碱性蛋白酶对鸡冠和肉牛进行水解,水解度平均值为18.6%,并在水解液中检测到具有抗氧化能力的水解物。杨留明等[19]采用酶解法水解牡蛎蛋白,发现时间为5h时,水解度为15.61%。而本试验与Bezerra等[18]、杨留明等[19]研究相比水解的时间更短,水解更完全,减少资源浪费。


4、结论


试验结果表明,酸水解明显受反应时间和温度的影响,延长水解时间,提高水解温度,可缩小产物的平均分子量得到更多的短肽;在水解温度为80、90、100℃时,水解时间分别低于6、5、4h时水解度都不超过50%,可以得到分子量分布在5.5kDa的短肽,综合分析得到水解度为50%时的适宜水解条件为温度90℃、反应时间4h。本试验方法证明了酸水解畜禽副产品的可行性,为饲料资源的开发及工业化规模生产提供参考。


参考文献:

[1]宁瑛,冯永森.饲料安全再认识[J].畜牧与饲料科学,2019,28(1):56-58.

[3]张邵博,靳冬武,李明生.蛋白水解物制备工艺及其在生物技术领域中的应用研究进展[J].天然产物研究与开发,2019,31(2):354-362.

[4]王淑娴,樊英,许拉,等.小肽对刺参免疫酶活性及抗病力的影响[J].中国饲料,2012(9):22-24,27.

[7]刘娜,张坤生,任云霞.鸡肉肌原纤维蛋白酶解产物的抗氧化活性研究[J].食品研究与发,2011,32(7):53-57.

[9]李月娟,吴霞明,王君,等.食品分析及安全检测关键技术研究[J].中国酿造,2012,31(12):13-17.

[10]张伟.凯氏定氮法测定食品中蛋白质[J].食品安全导刊,2016(24):114.

[11]林学清.鳗鱼多肽水解物酶法制备工艺研究[J].福建轻纺,2016(9):38-42.

[12]陈琳豪,金涛,刘艳妍,等.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳染脱色方法优化[J].浙江树人大学学报:自然科学版,2014,14(4):20-23.

[13]卫晶丽,刘百灵,杨礼,等.胆道闭锁的相关超声参数的Logistic回归分析[J].中国医疗设备,2019,34(10):82-85.

[14]何跃,尹静.基于GMDH的小样本数据预测模型[J].统计与决策,2011,32(10):11-13.

[15]李真顺,覃瑞,刘虹,等.马铃薯蛋白水解工艺及水解产物活性研究进展[J].长江大学学报:自然科学版,2019,16(2):97-99,120.

[19]杨留明,吕春霞,张登科,等.响应面法优化酸酶结合法水解牡蛎肽工艺[J].食品工业科技,2019,40(17):167-172.


张建胜,姜宁,张爱忠,白志辉.酸水解鸡肉蛋白制备短肽的研究[J].现代畜牧兽医,2020(10):4-8.

基金:国家重点研发计划项目(2018YFD0502102);国家自然科学基金(31472120)

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