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鸡肉蛋白酸水解制备短肽的研究

2020-10-14 266 上传者：管理员

摘要：试验以鸡肉粉为原料，在80、90和100℃条件下经6mol/L盐酸水解2、3、4、5、6、7、8、9、10和12h，选出利用酸水解法制备短肽的适宜条件，并研究该条件下水解产物分子量的分布范围。结果表明，试验鸡肉的含氮量为14.36%。水解度50%时的适宜水解条件为温度90℃、反应时间4h，产物的分子量分布在5.5kDa左右。

关键词：
水解时间
水解温度
短肽
酸水解
饲料研究
饲料资源开发
鸡肉
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蛋白质的开发利用是饲料研究中的重要内容。将动物蛋白应用到饲料生产中具有良好的生产效率、社会效益及经济效益。从饲料安全层面分析，应用动物蛋白饲料资源需要考虑安全隐患问题[1]。水解肽在我国畜牧业中的研究与应用备受关注，已有大量研究集中于从肉类食品中开发生物活性肽[2]。而通过酸解法将畜牧副产品加工转化为短肽饲料将会降低安全隐患，减少资源浪费。研究表明，蛋白水解物中的不同分子量的短肽除具有营养作用外，还具有生物活性，这些肽以外部分子信号形式对细胞的代谢和增殖产生作用，有利于增强细胞活力和促进细胞生长[3]。王淑娴等[4]研究表明，将小肽作为饲料添加剂可有效提高刺参的非特异性免疫能力。畜禽肉水解后获得的动物蛋白（HAP）均为短肽和L型游离氨基酸，蛋白水解液中的肽可以使其拥有一定的风味，不同风味特性与水解程度和肽链结构有关[5,6]。刘娜等[7]研究发现，通过纤维蛋白酶解鸡肉肌原得到的产物具有清除DHPP能力，其清除率可达84.70%。目前，酸水解法、碱水解法和酶水解法是水解鸡肉蛋白的常用方法。酸水解法是利用盐酸在一定温度条件下水解，可将蛋白转化为短肽。水解过程具有卫生安全、低成本性的优点。参数筛选出来，可以进行规模生产。但是，水解蛋白时的温度、盐酸的浓度和水解时间因蛋白种类的不同需要探讨。本试验利用鸡肉副产品作为原料进行水解，为饲料资源的开发及工业化规模生产提供参考。

1、材料与方法

1.1试验材料

鸡肉副产品来自黑龙江八一农垦大学动物科技学院饲养的三黄鸡。

1.2试验试剂

溶液Ⅰ：6mol/LHCl；溶液Ⅱ：0.01mol/LNaOH标准溶液，以邻苯二甲酸氢钾标定；溶液Ⅲ：中性甲醛溶液，在100mL的烧杯中倒入50mL的甲醛，用0.01mol/LNaOH滴定至中性；溶液Ⅳ：保存液25mL甘油，用蒸馏水稀释到250mL。

1.3试验仪器

梅特勒-托利多DELTA-320-PH计（北京东南仪诚实验室设备有限公司）、电热恒温鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）、D2G-6090真空干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）、电热恒温水浴锅（上海森信实验仪器有限公司）、电子分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）、TGL-16G离心机（上海安亭科学仪器厂）、旋转蒸发器（上海安亭科学仪器厂）、DYY-5电泳仪（PowerPacBasic公司）、电泳槽（北京六一仪器厂）、微量移液器（上海大龙仪器有限公司）、水平摇床（北京六一仪器厂）。

1.4试验设计

采用两因素3×10试验设计，将适量鸡肉溶于6mol/LHCl后，设计3个温度80、90、100℃，在3个不同温度条件下鸡肉水解2、3、4、5、6、7、8、9、10和12h（见表1），以水解度达50%左右为判断依据，确定酸水解的适宜条件；并利用SDS-PAGE对最适温度下的水解产物分子量的分布范围进行探究。

表1水解的温度与时间设计

1.5试验方法

1.5.1样品制备

鸡肉预处理：鸡肉副产品在常温条件下解冻，绞碎后进行干燥恒重（干燥温度60℃），干燥后粉碎过100目筛，制成鸡肉粉。鸡肉粉通过添加石油醚的方法进行脱脂[8]。具体步骤为：把沸程在30～60℃的石油醚和鸡肉粉混合，比例为4∶1，在20℃左右充分搅拌1h，在4℃条件下静止0.5h，回收石油醚作为废液处理，此过程重3次。在温度为65℃的鼓风干燥箱里驱除残留石油醚，即得脱脂鸡肉蛋白粉。准确称取35mg的样品于已标号的消化管中，加入10mL6mol/L的盐酸，经N2洗涤30s后封管，置于电热恒温鼓风干燥箱中，分别在80、90、100℃水解2、3、4、5、6、7、8、9、10、12h。到达反应时间后，将消化管取出，打开盖子，迅速置于高速真空干燥箱中挥发盐酸。挥酸后的水解液3000r/min离心10min，保留上清液。

1.5.2水解度的测定

(1）采用中性甲醛电位滴定法[9]测定游离氨基氮含量：烧杯中加入1mL水解液，添加不含CO2的蒸馏水2mL，用0.01mol/L的NaOH将pH值调节为8.2，添加中性甲醛溶液1mL，充分混匀静置10min。蛋白水解液用0.01mol/L的NaOH标准溶液滴定至pH值9.2，记录所用NaOH标准溶液的体积，用于计算其游离氨基氮的含量（mmol/L）。

(2）清液中的总氮量测定：称取0.03g鸡肉于消化管中，加1勺催化剂混合均匀，同时添加10mL硫酸，消煮炉预热1h，预热时温度不可太高。样品反应不在产生泡沫时，加热温度调至410℃，消煮管中的溶液变澄清后再加热15min。每个试样要一个空白样，在空白消化管中添加20mg蔗糖，其余代替样品。消化好的样品转移到100mL容量瓶中定容。样品总氮含量采用凯氏定氮法测定[10]。蛋白质水解度公式[11]如下：

公式1

1.5.3水解产物分子量的测定

本试验采用SDS-PAGE电泳银染法测定水解产物的分子量，以水解度达50%左右为判断依据，选择合适温度和水解时间内的水解物进行电泳[12]。试验中配置15%的分离胶和5%的浓缩胶，SDS-PAGE凝胶配方见表2。

表2SDS-PAGE凝胶配方

1.5.3.1样品的准备

将挥酸完毕的水解液置于旋转蒸发器中，在60℃水浴下蒸干，用蒸馏水重复洗涤3次，蛋白质样品与上样缓冲液混合均匀，分别以40℃水浴0.5h、60℃水浴10min和沸水中煮2min处理。

1.5.3.2制板、安装与跑样

(a)1.5mm制胶板的安装

将玻璃内槽（带磨砂边缘的为大玻璃片）和短玻璃片清洗干净，将玻璃板放在65℃烘干箱中烘干，待两块玻璃板都干燥后将短玻璃板置于玻璃内槽内侧（磨砂面的一侧），将两块玻璃板组装好后用力将两块玻璃板按压在密封条上，并将槽内的两端边缘封死避免液体发生侧漏。

(b）配制分离胶

在离心管中加入双蒸水、49.5%T3%C和凝胶缓冲液混合均匀。将10%PAGE胶凝固剂和PAGE胶促凝剂加入离心管中，迅速混合均匀倒入凝胶模具中，在分离胶溶液上轻轻覆盖1～3cm的水层，使凝胶表面保持平整静置，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面表示凝胶已聚合。

(c）配制浓缩胶

滤纸将残留的水吸去。在离心管中先加入双蒸水、49.5%T3%C和凝胶缓冲液然后混合均匀。将10%PAGE胶凝固剂和PAGE胶促凝剂加入离心管中，迅速混合均匀倒入凝胶模具中，将梳子插入凝胶内，聚合后，拔梳子时应小心，防止加样孔被破坏。

(d）点样、跑样与染色

将电泳槽放入4℃或冰水浴中，外槽加入阳极缓冲液（T1225），内槽加入阴极缓冲液（T121),30V预电泳10min，将样品（已经过Tricine专用上样缓冲液P1325处理）加入点样孔后30V电泳1h,100V电泳至溴酚蓝到达胶底部后停止电泳。电泳后取出凝胶，浓缩胶切除，将分离胶在固定液中浸泡30min，银染法染色30min，蒸馏水洗3次，甲醛显色2～15min，最后把蛋白胶放到蛋白凝胶成像系统中照相。

1.6数据统计与分析

试验数据结果以“平均值±标准差”表示，采用Excel对数据进行初步处理，SPSS22统计软件对数据进行回归分析，建立80、90、100℃条件下的水解时间对水解度的回归方程[13,14]。

2、结果与分析

2.1鸡肉蛋白氮含量结果

通过凯式定氮法测得此试验鸡肉的含氮量为14.36%。

2.2时间和温度对酸水解鸡肉蛋白的水解度的影响

2.2.1时间对鸡肉蛋白水解度的影响（见表3)

由表3可知，反应开始时，体系中底物充足时使大分子蛋白质含量迅速增加；之后大分子肽段裂解成更小的肽段和游离氨基酸。2～10h内水解度增加较快；4～8h内水解度上升缓慢。2～4h内增加速度较慢，10～12h内酸解时虽然鸡肉水解度有所增加，但比较缓慢。

表3温度和时间对鸡肉蛋白水解度的影响

2.2.2温度对鸡肉蛋白对水解度的影响（见表3)

由表3可知，当酸水解温度为90℃和100℃时只需4h水解度分别达到了49.54%和50.02%，而水解温度为80℃、4h时水解度仅仅达到46.32%，与前两个温度相比水解速度慢，从整体看温度越高酸水解速度就越快。

2.2.3酸水解的水解度与时间和温度的回归分析（见表4)

由表4可知，水解度与水解时间和温度存在极显著正相关关系（P<0.01）。反应温度相同，水解度随水解时间延长而增加。时间增加，水解度增加并不明显；考虑水解时间过长会增加能耗，增大生产成本，因此不再对时间大于12h的情况进行补充试验。由于90℃与100℃条件下水解度随着时间增加的变化不显著，考虑温度越高对肽键的破坏程度就会越严重，可能会导致短肽的性能消失以及能耗和成本增加。因此，本试验确定90℃为酸水解的适宜温度；根据此条件下拟合度最好的对数（log）曲线方程，确定4h为水解度达到50%的水解时间。

2.3水解产物蛋白SDS-PAGE结果分析（见图1)

由图1可知，90℃条件下水解2h，可看到相应的模糊条带，可分别得到20kDa和5.5kDa的肽，说明90℃水解2h可以获得短肽。同时，在同样的HCl浓度和温度条件下，水解3或4h，也能见到大约为5.5kDa的肽，超过这个分子量的蛋白比较少，而在5～12h之间的水解已看不到小分子的肽，未见明显条带。

表4酸水解的水解度随时间的回归方程

图1酸水解鸡肉蛋白多肽SDS-PAGE分析

3、讨论

试验主要研究温度和时间对鸡肉水解度的影响，酸水解鸡肉蛋白游离氨基酸与总酸的比值约为0.9。酸水解鸡肉时需要高温，有较好的杀菌效果，具有保存时间延长、生产周期短及提高生产力等优点[15]。研究表明，利用酸水解法水解蛋白质检测到水解液中有大量的氨基酸和短肽[16]，蛋白质水解度越大水解液中含氨基酸就会越多，而生物活性和其功能都会得到提升[17]。因此，想要得到目的肽段需要根据固定的水解度来达到。本研究中采用酸水解的方法来水解鸡肉制备短肽，发现水解率在36.82%～50%内可以得到5.5kDa的短肽。在90℃水解5～12h，水解度缓慢上升，水解率超过50%的短肽很少，是因为蛋白多已水解成氨基酸。本试验结果表明，通过方程模拟在水解温度为90℃时，水解时间2～5h，水解度就可以达到50%，通过检测可以看到5.5kDa的肽进一步验证这一观点。推测在80℃时，水解不超过6h也可以达到此效果，100℃水解不到4h也可以达到效果。Bezerra等[18]采用碱性蛋白酶对鸡冠和肉牛进行水解，水解度平均值为18.6%，并在水解液中检测到具有抗氧化能力的水解物。杨留明等[19]采用酶解法水解牡蛎蛋白，发现时间为5h时，水解度为15.61%。而本试验与Bezerra等[18]、杨留明等[19]研究相比水解的时间更短，水解更完全，减少资源浪费。

4、结论

试验结果表明，酸水解明显受反应时间和温度的影响，延长水解时间，提高水解温度，可缩小产物的平均分子量得到更多的短肽；在水解温度为80、90、100℃时，水解时间分别低于6、5、4h时水解度都不超过50%，可以得到分子量分布在5.5kDa的短肽，综合分析得到水解度为50%时的适宜水解条件为温度90℃、反应时间4h。本试验方法证明了酸水解畜禽副产品的可行性，为饲料资源的开发及工业化规模生产提供参考。

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