猪萨佩罗病毒(porcine sapelovirus, PSV)属单股正链RNA病毒，没有囊膜结构，2014年国际病毒分类委员会(ICTV)将其归为微RNA病毒科萨佩罗病毒属[1,2,3,4,5]。该病毒传播迅速，通过消化道扩散、蔓延，亦可通过猪相互接触传播。各年龄段猪均可感染PSV,以仔猪感染最为严重。发病后会出现各种临床症状，如脑脊髓灰质炎、繁殖障碍、腹泻、肺炎等。PSV在临床上易与其他病毒混合感染，如猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV),猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndr-ome virus, PRRSV)和猪细小病毒(porcine parvovi-rus, PPV)等[6],导致病情复杂严重，大量仔猪死亡，降低了同期生猪出栏率，严重制约了畜牧养殖业的发展。

PSV基因组大小为7.5～8.3 kb, 仅有1个开放阅读框，编码1个多聚蛋白[7,8,9]。PSV的蛋白结构组成与其他微RNA病毒类似，VP4、VP2、VP3和VP1组成了该病毒的衣壳[10],其中VP2、VP3、VP1蛋白均位于核衣壳外部，发挥主要的抗原效应，而短的VP4蛋白则位于核衣壳内部，不参与免疫应答[11]。RNA病毒的衣壳蛋白可保护病毒RNA不被环境中的RNA酶水解，以及将病毒RNA包装进入衣壳和将病毒RNA释放到宿主细胞的功能[12]。此外，病毒衣壳蛋白还可通过与宿主细胞膜上的受体结合介导最初的感染，决定宿主的范围；与整合素受体结合从而激发受体途径或线粒体途径的细胞凋亡[13,14]。

上世纪60年代，PSV在英国暴发[15],而后在中国、西班牙、巴西、韩国等国家迅速传播[12,16,17,18],截至目前，相关疫苗或抗病毒药物尚未被研发。我国PSV呈现多发、散发态势，近年来该病毒检出率不断提高，严重影响生猪生产性能，给养猪业带来重大损失。PSV在传播疾病的同时常常伴随着VP1基因的变异。VP1蛋白作为核衣壳组成成分之一，具有免疫原性，可作为血清学检测方法建立的候选蛋白。此外，VP1蛋白能诱导产生中和抗体，而中和抗体水平是研发疫苗的关键性指标之一，因此VP1是研发PSV疫苗的理想候选蛋白[19,20,21]。

本研究利用真核表达系统成功表达VP1蛋白，并通过构建PSV遗传进化树，揭示了PSV在全球范围内的流行情况，进一步以VP1基因为基础构建进化树，分析HNHB-01株与参考毒株间的遗传进化关系，随后对VP1进行同源性分析和蛋白结构预测。本研究不仅为PSV的诊断与预防提供依据，并且为今后研究VP1基因的功能和开发疫苗奠定基础。

1、材料与方法

1.1 病毒

猪萨佩罗病毒HNHB-01株由河南省动物性食品安全重点实验室保存。

1.2 主要材料

人胚肾上皮细胞(HEK-293T)、pCAGGS载体均由本实验室保存；DH5α感受态细胞购自北京擎科生物科技有限公司；PSV VP1单抗由本实验室制备；FITC标记的羊抗鼠二抗购自SIGMA公司；2×Rapid Taq Master Mix、DNA Marker购自南京诺唯赞生物科技有限公司；NEB T4 DNA连接酶、NEB SmaⅠ、NEB XhoⅠ内切酶均购自宝日医生物技术(北京)有限公司；质粒提取试剂盒购自OMEGA公司；DNA凝胶回收试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司。

1.3 主要仪器

NanoDrop-2000超微量紫外分光光度仪购自美国Thermo Forma公司；PCR核酸扩增仪购自美国Thermo公司；电泳仪购自北京六一仪器厂；紫外凝胶成像系统购Proteinsimple公司。

1.4 引物的设计与合成

基于GenBank上载录的PSV(登录号：MN939541)基因序列，运用Primer Premier 5.0软件，设计靶向VP1基因的特异性引物(表1),送至武汉奥科公司合成。

表1 VP1基因的引物序列

1.5 重组质粒的构建与鉴定

用TRIzol法提取RNA,反转录为cDNA后，以cDNA为模板，通过PCR扩增VP1基因，反应总体系为25 μL:2×Rapid Taq Master Mix 13 μL,ddH2O 9 μL,上、下游引物各0.5 μL,模板2 μL。扩增程序为：95 ℃ 5 min; 95 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 5 min, 35个循环。通过琼脂糖凝胶电泳，胶回收纯化PCR产物，然后利用SmaⅠ和XhoⅠ对pCAGGS载体和VP1基因进行双酶切，产物回收纯化，利用T4 DNA连接酶将连接产物转化至DH5α感受状态细胞，在含有Amp+的LB培养皿上37 ℃培养14～16 h, 挑取白色单菌落，利用通用引物进行PCR鉴定，随后提取重组质粒，对质粒进行双酶切鉴定，筛选出阳性重组质粒，送至武汉奥科公司测序，测序正确的质粒命名为pCAGGS-VP1。

1.6 Western blot检测 VP1 蛋白表达

首先将pCAGGS-VP1转染至HEK-293T细胞中，转染36 h后吸弃培养液，用 1 mL 预冷 PBS 洗细胞，加入RIPA细胞裂解液，置于冰上10 min, 收集VP1蛋白于EP管中，加入 25 μL 5×SDS loading buffer, 95 ℃加热 10 min。经12% SDS-PAGE后，在400 mA 1 h条件下将蛋白转印至NC膜上；使用5%脱脂奶粉室温封闭2 h; 以鼠源VP1单克隆抗体作为一抗，4 ℃过夜孵育；以TBST 缓冲液清洗5 次，每次5 min, 然后加入HRP标记的羊抗鼠 IgG二抗，室温孵育2 h; 以TBST 缓冲液清洗5 次，每次 5 min; 最终使用ECL成像系统进行检测。

1.7 间接免疫荧光(IFA)检测 VP1 蛋白表达

以HEK-293T细胞铺设12孔细胞培养板，待细胞长至80%时，将pCAGGS-VP1质粒转染至HEK-293T细胞中，36 h后吸弃维持液，用PBS洗涤2次，以预冷的无水乙醇4 ℃固定过夜；加入5% BSA室温封闭2 h; 以鼠源VP1单克隆抗体作为一抗，4 ℃孵育过夜；以0.05% PBST洗5次，每次5 min, 然后加入1∶100稀释的FITC标记的羊抗鼠二抗，室温孵育1 h; 以0.05% PBST洗5次，每次5 min; 加入含DAPI的封片剂染细胞核，置于荧光显微镜下观察拍照。

1.8 基于PSV全基因组遗传进化分析

从NCBI中选择各个国家具代表性的毒株序列，共33株(表2),运用MEGA 7软件的Neighbor-Joining算法(邻系接合法),基于Bootstrap method参数模式，自展值设置为1 000个重复，将HNHB-01毒株序列与NCBI上下载的32株毒株序列进行比对，而后建立PSV全基因组遗传进化发育树。

表2 PSV HNHB-01与其他PSV参考毒株信息

1.9 基于VP1基因遗传进化分析

运用MEGA 7软件的Neighbor-Joining算法，基于Bootstrap method参数模式，自展值设置为1 000个重复，从表2挑选17株参考毒株，建立VP1基因的遗传进化树，并对所得结果进行分析。

1.10 基于VP1抗原表位氨基酸突变的分析

应用DNAMAN软件对代表性参考毒株PSV VP1蛋白氨基酸序列与HNHB-01 VP1蛋白氨基酸序列进行比对，分析抗原表位氨基酸的突变情况。

1.11 VP1蛋白三级结构预测

登陆在线网址对VP1蛋白的抗原表位进行预测，然后登陆在线网址,预测VP1蛋白三级结构。

2、结果

2.1 pCAGGS-VP1重组质粒的构建与鉴定

以cDNA为模板，通过PCR扩增 VP1基因，获得了879 bp的VP1基因条带(图1A)。将连接产物转化至DH5α感受态细胞，经培养后挑取单菌落，通过PCR筛选出含有VP1目的基因的菌落，随后提取质粒，用限制性内切酶SmaⅠ和XhoⅠ进行双酶切鉴定，结果显示，酶切产物出现2条带，其中879 bp处有目的条带，符合预期结果(图1B)。进一步测序结果表明，PSV VP1基因被成功构建入pCAGGS载体中。

图1 VP1基因PCR扩增(A)和重组质粒pCAGGS-VP1的双酶切鉴定(B)   

2.2 Western blot和IFA检测VP1蛋白表达

将空载体pCAGGS和重组质粒分别转染HEK-293T细胞，转染36 h后裂解细胞，通过Western blot检测蛋白表达，结果显示(图2A),表达的VP1蛋白为36 kDa, 符合预期结果。而后将空载体pCAGGS(阴性对照)和重组质粒pCAGGS-VP1分别转染HEK-293T细胞，36 h后通过间接免疫荧光检测VP1蛋白的表达情况，结果显示(图2B),阴性组未见绿色荧光，而试验组存在大量绿色荧光。以上试验表明VP1蛋白成功表达。

图2 Western blot(A)和IFA(B)鉴定VP1蛋白   

2.3 基于PSV全基因组遗传进化分析

为揭示PSV在全球范围内的流行情况，应用MEGA 7软件的Neighbor-Joining算法，将HNHB-01株和从NCBI上下载的32株参考毒株建立遗传进化树(图3)。结果显示，所有的PSV全基因序列被分为2个大的亚群：GroupⅠ和GroupⅡ,实验室分离的HNHB-01株位于GroupⅠ-2,与2017年分离的HNXX-01株亲缘关系较近，其次与2017年流行的JXXY-a2株、2016年流行的PSV-A2株关系较近，说明河南毒株与2016—2017年流行的毒株可能为同一来源，而与2015年流行的HUN1株关系较远，与中国当前2019—2021年流行的毒株SHCM2019、PSV2020、GS01关系较远，同时与中国首次分离毒株csh关系更远，说明HNHB-01株与中国其他地区分离株进化程度具有差异，我国PSV存在地区间交叉感染。另外HNHB-01株与日本株JPSV-1315关系接近，而与印度株、韩国株、美国株、意大利株、英国株等处在不同的亚分支，亲缘关系较远，推测我国PSV可能从日本传入。

图3 基于PSV全基因序列构建的系统进化树   

2.4 基于VP1基因遗传进化分析

研究表明，微RNA病毒VP1基因变异性最大，容易发生突变和缺失，所以进一步以PSV的外层衣壳蛋白VP1基因为基础构建进化树，分析HNHB-01株VP1基因与17株参考毒株VP1基因间的遗传进化关系。如图4所示，PSV VP1基因序列被分为2个大群：GroupⅠ和GroupⅡ,其中GroupⅠ又分为GroupⅠ-1、GroupⅠ-2两大亚群，HNHB-01 VP1基因位于GroupⅠ-1,与国内2016—2017年流行的毒株HNXX-01、PSV-A2、JXXY-a2的VP1基因高度同源，而与HNXX-01株VP1基因位于同一分支，与国外2009年流行的日本毒株JPSV1315的VP1基因亲缘关系较近，推测我国PSV可能为日本传入，与印度株同属GroupⅠ-1亚群，具有一定的亲缘关系，但与韩国、美国、意大利等国外毒株亲缘关系较远。值得注意的是，HNHB-01株VP1基因与2019—2020年国内流行SHCM2019株、PSV2020株VP1基因亲缘关系较远，说明PSV在长期流行传播过程中，出现一定程度的变异，地缘性特征明显，HNHB-01株与当前国内PSV流行株存在明显遗传分化，研发疫苗时可考虑选择流行株为对象，以期提高疫苗保护力。

图4 基于PSV VP1基因序列构建的系统进化树  

2.5 基于VP1抗原表位氨基酸突变的分析

为了研究VP1蛋白特征，将16株参考毒株的PSV VP1基因编码的氨基酸序列与HNHB-01株VP1氨基酸序列的抗原表位区进行分析比较，结果显示，2016—2017年国内流行的4株毒株(HNHB-01、HNXX-01、PSV-A2、JXXY-a2)的VP1氨基酸高度同源，均不存在氨基酸的插入和缺失，但存在部分突变。HNHB-01株与HNXX-01株VP1氨基酸同源性最高，为99.32%;HNHB-01株VP1氨基酸与PSV2020株VP1氨基酸同源性最低，为80.13%;PSV-A2株VP1氨基酸序列与JXXY-a2株VP1氨基酸序列完全一致，表明两者来源为同一祖先。

与国内4株PSV分离株的VP1氨基酸相比，SHCM2019株VP1氨基酸共有24处突变，而PSV2020株的VP1氨基酸共有33处突变，且在B、C区域有一高变区，两者共同突变有16处，散布于A、B、C 3个区域。值得注意的是，PSV2020株的VP1氨基酸在第287～290存在连续4个氨基酸插入，这可能会影响PSV整体的功能(图5)。与2001年世界上首次分离的英国株V13 VP1氨基酸对比，国内4株PSV分离株的VP1氨基酸共有20处共同突变，以上数据表明近年来VP1蛋白变异频率越来越快。VP1蛋白作为PSV中核衣壳的组分之一，不仅可诱导产生高中和抗体，而且在病毒入侵增殖过程发挥着关键作用。PSV VP1蛋白的主要抗原表位在10～70 aa、90～105 aa、155～170 aa、205～215 aa、230～240 aa、265～285 aa 处，其中最优势抗原位点位于20～30 aa、90～100 aa、265～275 aa, 氨基酸变异位点主要集中在10～70 aa、205～285 aa区段。本研究分析出的集中突变区正好位于此区域内，VP1蛋白抗原表位区域氨基酸的突变是导致其毒力及抗原性发生改变的根本原因。以上种种数据表明，2019年后中国PSV流行株与国内其他分离株相比存在明显变异，出现了PSV变异株。

2.6 VP1蛋白三级结构预测

衣壳蛋白VP1与病毒逃逸宿主免疫有关，对致病性尤为关键。对VP1蛋白进行三级结构预测，以期进一步了解VP1蛋白功能。首先登录网址http: //www.iedb.org/对VP1蛋白抗原表位进行预测，VP1蛋白存在多个潜在的抗原表位(如图6A),挑选出3条最优势抗原表位氨基酸序列，然后登陆在线网址https: //swissmodel.expasy.org/,利用SWISS-MODEL程序进行同源建模，预测VP1蛋白三级结构，在所预测的VP1蛋白上，标记并放大3条抗原表位对应的氨基酸序列，分别为20～30 aa、90～100 aa、265～275 aa(图6B)。结果显示，3条抗原表位区对应的氨基酸均位于蛋白结构外侧，更易与抗体结合。Ramachandran评价显示蛋白结构稳定性均良好，表明预测结果成功。此次预测缩小了定位表位的范围，为抗体制备、免疫检测提供了一定的理论基础。

图5 VP1蛋白氨基酸序列分析   

图6 VP1抗原表位分析(A)与VP1蛋白的三维预测模型(B)   

3、讨论

近年来，PSV在中国猪场广泛分布[21],致死率较低，但感染性较高，且常和猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪细小病毒等混合感染，引起猪群生产性能下降，使中国养猪企业和养殖户蒙受巨大损失。迄今为止，尚无针对PSV的疫苗或药物投入市场，伴随着PSV检出率的逐年升高，亟需开展有关PSV的研究。

本研究采用PCR方法，扩增出PSV衣壳蛋白VP1基因，并成功构建真核表达载体pCAGGS-PSV-VP1,为今后研究VP1蛋白功能以及疫苗研制奠定了基础。同时，通过对我国PSV构建遗传进化发育树发现，HNHB-01株与HNXX-01株遗传进化关系最为接近，二者均分离于河南，其次与2016—2017年流行的PSV-A2、JXXY-a2中国株关系最近，而与中国2019—2021年流行的毒株SHCM2019、PSV2020、GS01关系较远，与中国首次分离毒株csh关系更远，说明HNHB-01株与中国其他地区分离株进化程度具有差异，我国PSV存在地区间交叉感染。另外，HNHB-01株与日本株JPSV-1315存在一定亲缘性，可能为日本传入，与英国、韩国、美国、印度分离株遗传距离较远。

由于PSV基因组和结构的特点，常常伴随着VP1基因的变异。本研究结果分析表明，2016—2017年国内流行的4株毒株(HNHB-01、HNXX-01、PSV-A2、JXXY-a2)的VP1氨基酸高度同源，并且PSV-A2株VP1氨基酸序列与JXXY-a2株VP1氨基酸序列完全一致，表明两者来源为同一祖先。与国内4株PSV分离株的VP1氨基酸相比，SHCM2019株VP1氨基酸共有24处突变，PSV2020株的VP1氨基酸共有33处突变，且氨基酸变异位点散布于抗原表位区，甚至PSV2020株的VP1氨基酸在第287～290存在连续4个氨基酸插入。而与世界上首次分离的英国株V13 VP1氨基酸对比，国内4株PSV分离株的VP1氨基酸共有20处共同突变。这些氨基酸的改变可能导致抗原性发生改变，对PSV生物学特性的意义还有待进一步的研究。

参考文献:

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基金资助:河南省杰出青年基金项目(202300410192);河南省科技攻关项目(212102110363);

文章来源:李朝阳,郝晨琳,曾权等.猪萨佩罗病毒HNHB-01株 VP1基因的表达与分子特征[J].畜牧与兽医,2024,56(01):83-90.