鸡源大肠杆菌是鸡肠道中的一种正常寄居的革兰阴性菌。作为条件性致病菌，会引起尿道、胃肠道、关节炎、脑膜炎及败血型感染，大肠杆菌病在细菌性疾病中位列世界第一[1,2]。临床上预防和治疗鸡源大肠杆菌感染主要依赖抗菌药，然而由于抗菌药的大量且不规范使用，大肠杆菌的耐药问题日趋严重，多重耐药现象普遍[3]。大肠杆菌耐药性的产生与生物被膜的形成密切相关。细菌生物被膜(bacterial biofilm, BF)是细菌在生长过程中为适应生存环境而吸附于物体表面并通过增殖、分泌胞外基质而形成的一种具有一定空间结构的细菌群体[4]。生物被膜的形成使其具有比浮游菌更高的耐药性，导致生物被膜相关感染更难根除和更容易复发[5]。

大肠杆菌携带耐药基因和毒力因子种类众多，前者主要针对不同抗菌药物产生耐药性；后者包括外膜蛋白基因ompA、ompT[6]、血清抗性蛋白基因iss、转译激活因子基因aggR、耶尔森菌强毒力岛基因irp1、irp2、侵袭蛋白调节基因invE、热稳定肠毒素基因astA等[7]。两者与细菌的宿主细胞入侵能力、毒力及致病性有关。关于生物被膜形成能力和不同抗菌药物耐药性，不同耐药基因、毒力基因携带及表达量之间的关系，目前尚不明确。

因此，本研究检测临床分离菌株的生物被膜形成能力，比较生物被膜阳性菌株和阴性菌株在常见抗菌药物耐药性与毒力基因携带上的差异，并分析不同生物被膜形成能力菌株毒力基因表达量之间的关联性，以期为揭示大肠杆菌生物被膜菌株的耐药性、致病机理奠定基础。

1、材料与方法

1.1 菌株与试剂

51株鸡源大肠杆菌，为河南农业大学药理实验室分离保存，并分别以E1～E51编号命名；质控菌为大肠杆菌ATCC®25922;LB肉汤、BHI肉汤、LB琼脂、MHB培养基、TSB培养基，均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；FastTaq Premix, 购自TOLOBIO公司；DL2000 DNA Marker(50 ng/μL)、2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix购自诺唯赞生物科技股份有限公司；抗菌药物由河南牧翔动物药业有限公司馈赠。

1.2 生物被膜阳性菌株筛选及形成能力测定

参考范玉堂[8]的刚果红琼脂试验方法，挑取菌液划线于刚果红平板上，37 ℃培养24 h后，于室温培养3～5 d, 每天观察并记录结果。红色菌落逐渐转变为黑色菌落且有光晕，判定为生物被膜阳性菌株，没有明显变化的判定为生物被膜阴性菌株。

挑取生长在LB琼脂板上的各分离菌株单菌落，于TSB肉汤培养基中，37 ℃过夜震荡培养；取无菌24孔板，每孔加500 μL菌液、每组3个平行，阴性对照为TSB培养液。37 ℃静置培养72 h, 无菌去离子水洗去浮游菌；甲醇固定、结晶紫染色、冰乙酸脱色。每孔吸取200 μL于无菌96孔板，用酶标仪测定波长600 nm的OD值。

1.3 药物敏感性试验

采用美国临床实验室标准协会(CLSI)推荐的微量肉汤稀释法，测定51株大肠杆菌菌株对阿莫西林+克拉维酸、头孢喹肟、庆大霉素、阿米卡星、氟苯尼考、多西环素、恩诺沙星、黏菌素8种抗菌药的敏感性，其中耐药折点(R)分别为R>8 μg/mL、R>2 μg/mL、R>4 μg/mL、R>16 μg/mL、R>8 μg/mL、R>8 μg/mL、R>2 μg/mL、R>2 μg/mL。耐药判断标准为：最小抑菌浓度(MIC)是否大于CLSI规定的耐药折点，若大于即为耐药。质控菌质控范围分别为：阿莫西林+克拉维酸2～8 μg/mL;头孢喹肟0.03～0.25 μg/mL;恩诺沙星0.008～0.03 μg/mL;阿米卡星0.5～4.0 μg/mL、多西环素0.5～2.0 μg/mL、氟苯尼考2～8 μg/mL;庆大霉素0.25～1.00 μg/mL;黏菌素0.25～2.00 μg/mL。每株菌设3个平行，取平均值。

1.4 耐药及毒力基因的检测

参考相关文献合成耐药及毒力基因引物[9,10,11],序列见表1。10种耐药基因分别为：β-内酰胺类(blaCTX-M-U、blaCTX-M-9、blaOXA-1),酰胺醇类(floR),四环素类(tetA、tetB、tetC、tetD),氨基糖苷类(rmtB),多肽类(mcr-1);31种毒力基因分别为：紧密黏附素基因(fimH、fimC、tsh、eaeA、eae、sfa),毒素相关基因(astA、aggR、hlyF、elt、estA、estB、stx1、stx2、vat、ler),铁摄取系统相关基因(irp1、irp2、iucD、fyuA、ybtA、iroN),编码外膜蛋白基因(ompT、ompA、papC、ler、escV),编码血清抗性蛋白基因(iutA、iss、colV、invE)。PCR反应体系(20 μL):2× FastTaq Premix 10 μL,上、下游引物(10 μmol/mL)各0.5 μL,菌液1.0 μL,ddH2O补足体系。反应程序：94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s, 51.5～65.5 ℃退火30 s, 72 ℃延伸，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.5 毒力基因表达量测定

利用诺唯赞生物科技有限公司反转录和定量试剂盒进行反转录和定量PCR检测，按照说明书操作。fimH、fimC、iucD、hlyF、ompA毒力基因引物由擎科生物科技股份有限公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.6 数据统计与分析

应用Prism.exe软件进行统计学分析，结果用t检验分析，数据以“平均值±标准差”表示，当P<0.05时，认为有显著性差异。

2、结果

2.1 生物被膜阳性菌株检出结果

51株大肠杆菌菌株的刚果红琼脂试验中(图1),共有10株菌株红色菌落逐渐转变为黑色菌落且有光晕，生物被膜阳性率19.61%,其余41株无变化为阴性菌株。其中10株生物被膜阳性菌株编号分别为E11、E13、E21、E30、E24、E44、E42、E32、E45、E39。

图1 生物被膜阳性菌株筛选   

2.2 生物被膜形成能力测定结果

对10株生物被膜阳性菌株结晶紫染色，测其OD值。结果显示E13菌株OD值最大为2.233±0.702;E11、E21、E24、E30、E42、E44 OD值介于1.455～1.604之间(表2),E32、E39、E45菌株结晶紫染色后OD值分别为0.325、0.374、0.418。选取最高OD值以及最低OD值菌株对比，如图2可以看出E13、E39菌株结晶紫染色后，生物被膜量有明显区别。

表2 10株生物被膜阳性菌OD值

图2 E13、E39形成生物被膜后的结晶紫染色   

2.3 生物被膜阳性菌株和阴性菌株耐药性的比较

从表3中可以看出，51株临床分离株对阿莫西林、恩诺沙星耐药率均较高，达到90%以上，但生物被膜阳性菌株和阴性菌株差异不显著；总分离菌株对氟苯尼考、头孢喹肟、庆大霉素耐药率分别为70.59%、64.71%、56.86%,且生物被膜阳性菌对以上3种药物耐药率均高于阴性菌株，但差异不显著；生物被膜阳性菌株更容易对阿米卡星、黏菌素耐药，且与生物被膜阴性菌株相比差异显著；值得关注的是，生物被膜阳性菌株对多西环素的耐药率明显低于阴性菌株，差异显著。

表3 鸡源大肠杆菌生物被膜阳性菌株和阴性菌株的耐药性比较

2.4 生物被膜阳性菌株耐药情况

10株生物被膜阳性菌株中，OD值最大的E13对8种抗菌药全部耐药，6株OD值介于1.455～1.604的菌株对5种及以上抗菌药产生耐药性；OD值小于0.5的菌株E39为敏感菌株。其中有8株生物被膜阳性菌对3种以上抗菌药耐药，多重耐药率80%,共有8种耐药谱，表4可知，其中E11、E21、E30有相同的耐药谱(阿莫西林+克拉维酸)+头孢喹肟+恩诺沙星+氟苯尼考+庆大霉素+阿米卡星+黏菌素。表4所示抗菌药物对生物被膜阳性菌株的MIC值较高，其中阿莫西林+克拉维酸、头孢喹肟、庆大霉素、阿米卡星对部分菌株的MIC值大于512 μg/mL,说明生物被膜形成能力强的菌株耐药更为严重。

表4 各抗菌药物对生物被膜阳性菌株的MIC

2.5 耐药基因携带情况

表5可知，blaCTX-M-9、blaCTX-M-U、blaOXA-1、mcr-1、rmtB、floR在生物被膜阳性菌株中的检出率高于阴性菌株，与耐药表型对应；四环素类耐药基因tetA、tetB、tetC、tetD在生物被膜阳性菌株中的检出率低于阴性菌株检出率，与多西环素耐药性检测结果对应。

2.6 毒力基因携带情况

对51株大肠杆菌进行毒力基因检测，其中31种毒力基因共检出16种(图3)。各基因检出率见表6。基因fimH、astA、aggR、irp1、iucD、fyuA、ybtA、ompA在生物被膜阳性菌株中的检出率高于阴性菌株，且差异显著；生物被膜阳性菌株最少携带4种毒力基因，最多携带13种基因，共有10种毒力基因型，见表7。

表5 不同生物被膜形成能力鸡源大肠杆菌耐药基因检出率对比结果

图3 鸡源大肠杆菌不同毒力基因的PCR检测结果   

表6 不同生物被膜形成能力鸡源大肠杆菌毒力基因检出率对比结果

表7 生物被膜阳性菌株毒力基因型

2.7 毒力基因表达量情况

通过荧光定量PCR检测生物被膜阳性菌株中检出率高的fimH(100%)、ompA(100%)、fimC(70%)、hlyF(70%)、iucD(80%)毒力基因表达量情况，如图4所示。以OD值较小的菌株E39为对照，测定E13、E11、E21、E30、E24、E44、E42菌株中基因表达量，结果发现7株生物被膜形成能力较强的菌株中，除E44中fimH表达量下调外，其余菌株中基因表达量均上调。

图4 生物被膜阳性菌株毒力基因相对表达量   

3、讨论

大肠杆菌是鸡最常见的病原体之一，而大肠杆菌生物被膜的形成会导致各种感染的发生且根除困难。生物被膜是细菌群体被自身胞外多聚物包裹，不可逆地附着于接触表面而形成的有组织的膜状物质，这是细菌为适应自然环境有利于生存的一种生命现象。生物被膜菌比浮游菌对抗菌药的耐受性提高10～1 000倍[12]。本试验通过刚果红琼脂试验测得生物被膜阳性菌株检出率19.61%,与蔺飞等[13]研究结果(27.66%)相似。近年来，细菌生物被膜阳性菌株逐渐增多，耐药现象严重。本研究发现，生物被膜阳性菌株对头孢喹肟、氟苯尼考、黏菌素、庆大霉素、阿米卡星的耐药率分别为70%、80%、40%、70%、50%,高于阴性菌株耐药率。10株生物被膜阳性菌株中，共有8株对3种以上抗菌药耐药，多重耐药率80%,共有8种耐药谱，与刘璨颖等[14]、周陆红等[15]研究结果基本一致。OD值最大的E13菌株对8种抗菌药均耐药，携带9种本研究检测耐药基因；E11、E21、E30菌株耐药谱为(阿莫西林+克拉维酸)+头孢喹肟+恩诺沙星+氟苯尼考+庆大霉素+阿米卡星+黏菌素。说明生物被膜形成能力越强，耐药性越强，耐药谱越广，耐药基因检出率高，基因型也越复杂。

细菌生物被膜的形成与多种毒力因子如铁摄取系统、黏附素、肠毒素基因等有关；毒力基因属于DNA片段，能够编码细菌致病基因组，与细菌致病性、生殖进化有一定关系。有研究表明大肠杆菌致病性与自身携带的毒力基因有相关性，因此可以从大肠杆菌的毒力基因携带及表达水平研究菌株的致病机理[16]。本试验对51株鸡源大肠杆菌进行毒力基因检测，PCR结果显示共有iss、aggR、fimC、fimH、ompA等16种毒力基因检出，基因aggR、astA、ompA、iucD、fyuA、fimH、ybtA、irp1在生物被膜阳性菌株中的检出率高于阴性菌株，且差异显著。ler、eaeA、sfa、escV、eae、estA、estB、elt均未检出，与陈亚强[7]、李巧玲[9]试验结果一致。ompA基因属于大肠杆菌细胞壁中脂质双层结构的外膜蛋白，能够增强细菌对物质的运输能力及抵抗机体免疫[6],与抗菌药耐药性、侵袭性和生物被膜形成有关[17];fimH基因在生物被膜形成过程中起到黏附素的作用，参与生物被膜不可逆黏附阶段[18]。试验结果显示ompA、fimH基因在生物被膜阳性菌株中的检出率均为100%,在阴性菌中的检出率分别为95.12%、92.68%,差异具有统计学意义；ompA、fimH检出率与蔺飞[13]、曲凤仪[10]的试验结果相一致，本试验结果与赵李祥[11]、钟杏好[19]的结果相近，均在90%左右。其中毒力基因ompA、fimH、fimC、iucD、hlyF检出率较高，故以OD值较小的E39菌株为对照，测定5种基因在OD值介于1.455～1.607的菌株中表达量变化。qPCR结果显示生物被膜阳性菌株中除E44中fimH表达量下调外，其余菌株中基因表达量均上调，总体来说毒力基因表达量呈现上调趋势，可能毒力基因的存在促进了生物被膜的形成，导致耐药现象严重。杨进等[20]研究表明强生物被膜形成能力菌株中fimH基因的检出率高于弱成膜形成能力菌株，提示这些毒力基因在生物被膜形成过程中发挥着重要作用。

细菌生物被膜的形成导致耐药现象越来越严重，形成生物被膜的细菌感染后治疗更加困难，且有复发的机会[21]。目前临床上多种抗菌药治疗效果差，不仅要考虑耐药性因素，更要深入研究生物被膜形成后产生的耐药机制[22]。本试验中生物被膜阳性菌株耐药现象严重，且有多种耐药谱、基因型，说明耐药性、毒力基因表达量上调与生物被膜的形成显著相关。

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基金资助:国家自然科学基金面上项目(32072914);河南省重点研发项目(221111111300);

文章来源:陶梦珂,李苗苗,石晴晴,等.鸡源大肠杆菌生物被膜形成与耐药性､毒力基因的关联性分析[J].畜牧与兽医,2024,56(06):86-93.