肠道是动物消化和吸收营养物质重要场所，也是参与分泌和免疫的重要器官[1],随着饲粮中禁止添加抗生素以后，通过添加绿色安全中药提取物从而改善家禽肠道健康已经成为当下研究热点。肠道健康是动物机体健康水平重要的参考指标，对于提升动物的生产性能非常重要，研究表明中药多糖可通过改善肠道结构和调节肠道菌群促进肠道健康，并且广泛运用于肉鸡生产中[2,3,4,5]。

猴耳环是我国传统中药材，富含黄酮类、黄烷类以及有机酚酸类等药用活性成分，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降血糖等功能[6,7,8,9,10,11],猴耳环及其提取物具有多成分、多靶点、多途径、多环节的功能优势，一方面对细菌感染造成的疾病能起到有效抑菌的效果；另一方面能够在机体整体方面提高免疫能力、减缓疾病发生过程中造成的损坏。研究表明，猴耳环提取物对产气肠杆菌、肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌等细菌有较好的抑菌效果[12];另外，猴耳环提取的槲皮素在体外能够有效降低呼吸道合胞病毒(RSV)活性，其半数抑制质量浓度(IC50)为2.5 mg/L,具有较强的抗病毒效果[13];此外，猴耳环提取物还具有调节机体免疫功能、缓解组织炎性损伤的功能，研究表明，猴耳环提取物对化疗药物环磷酰胺(CTX)的保护作用研究中发现，猴耳环处理组的集落刺激因子(GM-CSF)和IFN-γ水平显著升高[14]。目前猴耳环在动物养殖领域应用方面的研究较少，而猴耳环对动物生产性能及肠道健康等方面的研究还未见报道。本研究通过探究在饲粮中添加不同浓度的猴耳环提取物对黄羽肉鸡肠道健康的影响，为将猴耳环开发成一种天然、安全、有效的饲料添加剂提供数据支撑和理论依据。

1、材料与方法

1.1 试验材料

试验用猴耳环提取物产品为深褐色粉末，可溶于水，其中有效成分为猴耳环多酚，有效成分含量为68%,由广东态合堂实业有限公司提供；1日龄黄羽肉鸡购自广州市江丰实业股份有限公司；TRIzol总RNA提取试剂购自Thermo Fisher公司；PrimeScriptTM反转录试剂盒和TB Green Fast qPCR试剂盒购自TaKaRa公司；4%多聚甲醛固定购自北京鼎国生物科技有限公司。

1.2 试验方法

动物试验于2021年7月—2021年9月在仲恺农业工程学院教学科研基地进行。选取体质量相近的1日龄黄羽肉鸡240只，随机分成A、B、C、D 4个组(n=60),每组6个重复，每个重复10只。试验按照黄羽肉鸡常规饲养流程和免疫程序，从1日龄开始，A、B、C组分别在基础饲粮中添加质量浓度为0.5、1.0和2.0 g/kg的猴耳环提取物；D组为空白对照组。试验期为70 d, 分为1～20、21～40、41～70日龄3个阶段饲养，基础饲粮组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) %

1.3 肠道指标则定

试验第20、40和70天随机从每组选取6只鸡，分别采集空肠、十二指肠和盲肠内容物。各试验组采集的十二指肠和空肠组织经4%多聚甲醛固定，制作石蜡切片并进行HE染色，显微镜观察各组肠绒毛的形态结构，统计各试验组十二指肠和空肠组织肠道绒毛长度、隐窝深度及绒毛高度/隐窝深度(V/C),评估猴耳环提取物对黄羽肉鸡肠道健康的影响。

1.4 空肠组织中相关基因测定

利用TRIZol(Thermo Fisher公司)提取各试验组黄羽肉鸡空肠组织RNA,进一步通过PrimeScriptTM反转录试剂盒(TaKaRa公司)进行反转录反应；以cDNA为模板，利用特异性引物通过qPCR对空肠组织中的CLDN1等紧密连接蛋白以及IL-1β等炎性因子和相关通路的基因表达水平进行测定。按照2×Perfect Start Green Fast Mixture with ROXⅡ(Genestar)说明书配制20 μL反应体系：2×Perfect Start Green Fast Mixture with ROX Ⅱ 10.0 μL,上、下游引物各0.5 μL,cDNA 1.0 μL,ddH2O 8.0 μL;反应条件：95 ℃ 2 min; 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 共40个循环，每个样品设3次重复，结果采用2-△△Ct计算基因的相对表达量，相关引物序列如表2所示。

1.5 盲肠内容物16S rDNA 扩增子测序

表2 引物序列

R:CCCGGTTTCTAGA

分别提取试验第70天各组盲肠内容物总基因组DNA,对16S rDNA的V3-V4区进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行纯化和回收。使用TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经质检合格后，使用Illumina NovaSeq平台进行上机测序。对测序得到的原始数据(raw data)进行拼接、过滤，得到样本有效数据(clean data),并根据测序结果中的有效数据进行OTUs(operational taxonomic units)聚类分析和物种分类分析。盲肠内容物16S rDNA扩增子测序送由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。

1.6 数据统计分析

数据分析采用IBM SPSS26的一般线性模型GLM过程的One-way ANOVA进行单因素方差分析，并通过Duncan多重比较进行差异显著性分析。结果以表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著，P>0.05表示差异不显著。

2、结果

2.1 饲粮中添加猴耳环提取物对黄羽肉鸡十二指肠和空肠组织结构的影响

肠道组织切片结果显示，各试验组鸡十二指肠和空肠组织黏膜结构完整，肠绒毛排列整齐，绒毛间和隐窝之间界限分明(图1、2)。进一步对十二指肠和空肠组织绒毛长度、隐窝深度和绒隐比进行测定，结果如表3所示，试验第20天，A和B组十二指肠绒隐比显著高于对照组(P<0.05),分别高于对照组11.2%和24.4%;且C组十二指肠绒毛长度也显著高于对照组约11.9%(P<0.05),但绒隐比无显著差异(P>0.05);试验第40天，A、B和C组十二指肠的绒隐比均显著高于对照组(P<0.05),分别高于对照组33.1%、52.0%和36.2%;试验第70天，A、B和C组的绒毛长度与对照组相比均显著升高(P<0.05),分别高于对照组24.2%、12.6%和33.0%,但绒隐比无显著差异(P>0.05)。

如表4所示，试验第20天，A和B组空肠绒毛长度和绒隐比与对照组相比均显著升高(P<0.05),分别高于对照组约30.0%和23.6%;试验第40天，A、B和C组空肠绒毛长度均显著高于对照组(P<0.05),且C组绒隐比显著高于对照组(P<0.05),分别高于对照组约13.3%、58.3%和52.7%,且C组绒隐比显著高于对照组约19.5%(P<0.05),但A和B组绒隐比与对照组相比无显著变化(P>0.05);试验第70天，A和B组的空肠绒毛长度显著高于对照组(P<0.05),但其绒隐比与对照组相比无显著变化。以上结果表明，饲粮中添加猴耳环提取物可有效改善黄羽肉鸡肠道黏膜结构，促进肠道结构发育。

2.2 饲粮中添加猴耳环提取物对黄羽肉鸡空肠组织紧密连接蛋白表达水平的影响

为了解猴耳环提取物对黄羽肉鸡空肠组织屏障结构蛋白的影响，进一步对空肠组织中的CLDN1、CLDN5和OCLN等紧密连接蛋白的基因表达水平进行测定。结果显示，试验第40天，A组空肠组织中CLDN1的mRNA水平显显著高于对照组约74.1%(P<0.05),但各试验组空肠组织中CLDN5和OCLN的mRNA表达水平无显著变化(P>0.05)(图1)。此外，B组在试验第70天空肠组织中的CLDN5的mRNA表达水平与对照组相比也显著升高，高于对照组约2.5倍(图3)。以上结果表明，饲粮中添加猴耳环提取物可显著提高黄羽肉鸡空肠组织中CLDN1和CLDN5的mRNA表达水平，改善空肠组织中的物理屏障功能。

图1 猴耳环提取物对黄羽肉鸡十二指肠组织形态的影响(×50)   

图2 猴耳环提取物对黄羽肉鸡空肠组织形态的影响(×50)   

表3 猴耳环提取物对黄羽肉鸡十二指肠绒毛长度、隐窝深度和绒隐比的影响

表4 猴耳环提取物对黄羽肉鸡空肠绒毛长度、隐窝深度和绒隐比的影响

2.3 饲粮中添加猴耳环提取物对黄羽肉鸡空肠组织中炎性细胞因子及相关通路基因表达水平的影响

如图4所示，试验第20和40天各试验组空肠组织中IL-1β和IL-8的mRNA表达水平无显著差异(P>0.05);但试验第70天，试验组空肠组织中IL-1β和IL-8的mRNA表达水平显著低于对照组(P<0.05)。此外，在试验第70天，A、B和C组空肠组织中TNF-α的mRNA表达水平显著低于对照组(P<0.05),与对照组相比分别降低约36.8%、65.8%和63.2%。

图3 空肠组织中紧密连接蛋白CLDN1(A)、CLDN5(B)和OCLN(C) mRNA表达水平   进一步对各试验组空肠组织中炎性因子相关通路(TLR-4、MyD88和NF-κB)的基因表达水平进行测定，结果显示，试验第20天，A组空肠组织中TLR-4、MyD88和NF-κB的mRNA表达水平与对照组相比均显著降低(P<0.05),分别降低约79.2%、80.8%和77.3%。此外，试验第70天，A、B和C组空肠组织中NF-κB的mRNA表达水平显著低于对照组(P<0.05),分别降低约47.6%、52.4%和69.0%。以上结果表明，饲粮中添加猴耳环提取物可降低空肠组织中炎性细胞因子及相关通路的基因表达水平。

图4 空肠组织中炎性细胞因子及相关通路基因表达水平   

2.4 饲粮中添加猴耳环提取物对黄羽肉鸡盲肠微生物群的影响

分别在门(phylum)和属(genus)水平上对各试验组盲肠微生物丰度排名前10的物种进行分析，发现拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)为各试验组共同的优势菌(图5A);而在属水平上，拟杆菌属(Bacteroides)和粪杆菌属(Faecalibacteriumes)为各试验组的优势菌属(图5B)。通过LEfSe对试验第70天各试验组鸡盲肠微生物的主要差异菌群进行分析，结果显示，在门水平上B组的盲肠中的变形菌门的相对丰度与对照组相比显著降低(P<0.05)(图5C);在属水平上A组盲肠微生物菌群中普雷沃菌属的相对丰度显著高于对照组(P<0.05),且B和C组盲肠微生物菌群中普雷沃菌属的相对丰度与对照组相比也有升高的趋势，但差异不显著(P>0.05)(图5D)。此外，A和C组盲肠中副拟杆菌属的相对丰度显著高于对照组(P<0.05)。以上结果表明饲粮中添加猴儿环提取物可降低黄羽肉鸡盲肠中变形菌等有害菌的丰度，并且增加普雷沃菌属和副拟杆菌属等有益菌群的丰度，从而促进肠道健康。

图5 猴耳环提取物对盲肠菌群丰度的影响   

3、讨论

肠道是家禽消化和吸收营养物质重要的器官，也是禽类机体内最大的分泌和免疫器官。肠道中小肠绒毛长度和隐窝深度及其比值(绒隐比)是反映肠道黏膜结构和肠道健康的重要指标，肠道绒毛长度和绒隐比越大，表明肠道越健康，吸收功能也越好。ZHANG等[15]研究发现饲粮中添加鼠李糖脂可以提高空肠组织中的绒毛高度以及绒隐比，并且促进盲肠微生物的多样性；鼠李糖脂对于LPS攻毒后的黄羽肉鸡也能够改善肠道绒毛形态的作用。没食子酸作为猴耳环提取物的有效活性成分，研究表明没食子酸可提高仔猪空肠绒毛高度和降低隐窝深度，从而增加绒隐比，并增加肠黏膜sIgA的分泌及降低促炎细胞因子的表达[16,17]。本试验结果表明，在饲粮中添加猴耳环提取物可显著增加黄羽肉鸡空肠和十二指肠的绒隐比，从而改善肠道黏膜结构。肠道菌群失衡与肠黏膜屏障的破坏密切相关，研究表明饲粮添加白藜芦醇可提高黄羽肉鸡空肠、回肠的绒毛高度和绒隐比，上调空肠黏膜中紧密连接蛋白相关基因表达，并且降低黏膜中内毒素和各炎症因子的含量，从而有效缓解热应激导致的肠道损伤[18]。

SONG等[19]研究发现人参皂苷Rg1可以提高CLDN1和ZO-1的基因表达水平；饲粮中添加小檗碱(黄连素)可以提升黄羽肉鸡空肠黏膜CLDN1基因表达水平，并且降低IL-1β、IL-8和TNF-α基因表达水平[20]。本试验中饲粮中添加质量浓度为0.5和1.0 g/kg的猴耳环提取物可以显著提高黄羽肉鸡空肠组织中CLDN1和CLDN5的基因表达水平，并且降低IL-1β、IL-8和TNF-α等炎症因子的基因表达水平，有助于保护肠道黏膜结构和减轻肠道的炎性损伤，促进黄羽肉鸡的肠道健康。Toll样受体4(TLR4)/髓样分化因子88(MyD88)依赖途径在炎症反应中起到了重要的作用[21],MyD88是含有TIR结构域的接头蛋白，当TLR4被细菌释放的LPS等激活后通过TIR区域向胞内传递信号，通过一系列反应最后激活核转录因子-κB(NF-κB)等，导致IL-6、TNF-α等的大量释放[22],ZHAO等[23]通过饲粮中添加葡萄糖氧化酶饲喂北京油鸡，发现能够提升TLR4基因表达水平。本试验结果表明饲粮中添加猴耳环提取物可显著降低黄羽肉鸡空肠组织中的TLR4、MyD88和NF-κB的基因表达水平，与空肠组织炎性因子基因表达水平结果相符。

本试验中黄羽肉鸡盲肠中的主要菌群与前期报道结果基本一致[24,25],畜禽的免疫和消化能力与厚壁菌门的相对丰度降低或者拟杆菌门的相对丰度提升有关，研究表明厚壁菌门/拟杆菌门比例与脂肪沉积有关，改善畜禽的新陈代谢及减少脂肪沉积与比例数值呈负相关[26],本研究结果显示，拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)为各试验组共同的优势菌。变形菌门是细菌当中最大的一门，其中包括多数的病原菌，如大肠杆菌、沙门菌、霍乱弧菌、幽门螺杆菌等。本试验结果表明饲粮中添加质量浓度为1.0 g/kg的猴耳环提取物能显著降低盲肠中变形菌门的相对丰度。此外，试验组盲肠菌群中普雷沃菌属和副拟杆菌属的丰度与对照组相比显著性升高，其中副拟杆菌属是肠道核心菌群之一，并且普雷沃菌也广泛分布在动物的胃肠道中，主要的作用包括提高碳水化合物和蛋白质的降解以及维持消化道的内环境稳定[27]。因此，饲粮中添加猴耳环提取物可降低黄羽肉鸡肠道中变形菌门等有害菌群的丰度，并提高普雷沃菌属等有益菌群的丰度，从而促进肠道健康。

参考文献:

[1]孙永波,王亚,萨仁娜,等.家禽肠道健康评价指标研究进展[J].动物营养学报,2017,29(12):4266-4272.

[2]李贞明,张贝贝,余苗,等.植物提取物的生物学功能及其在肉鸡生产中的应用进展[J].广东农业科学,2019,46(6):110-117.

[3]曾丽,蔡旭滨,闵思明,等.牛至油对断奶仔猪小肠形态､细胞因子含量及紧密连接蛋白mRNA表达的影响[J].中国兽医学报,2022,42(7):1418-1423.

[4]郑晨曦,冯嘉轩,陈昭彤,等.葛根芩连汤对溃疡性结肠炎小鼠肠道屏障的保护作用机制[J].中国兽医学报,2023,43(3):571-576.

[13]李药兰,李克明,苏妙贤,等.猴耳环抗病毒有效成分研究[J].中国中药杂志,2006,20(5):397-400.

[16]蔡龙.没食子酸调控断奶仔猪肠道炎症反应的分子机制[D].北京:中国农业科学院,2020.

[18]何邵平.白藜芦醇对热应激黄羽肉鸡免疫功能调控及分子机制研究[D].长沙:湖南农业大学,2019.

[20]朱翠,黄凯勇,李丽娜,等.小檗碱对黄羽肉鸡器官指数,抗氧化能力和肠道免疫功能的影响[J].中国畜牧兽医,2022,49(3):932-941.

[21]孟艳鸽,李岩.不同剂量长双歧杆菌对抗生素诱导大鼠肠道菌群失调的疗效观察[J].中国微生态学杂志,2015,27(3):280-283.

[27]张洁,张力莉,徐晓锋.反刍动物瘤胃内普雷沃氏菌的研究进展[J].中国饲料,2020,21(7):17-21.

基金资助:广东省基础与应用基础研究基金区域联合基金-青年基金资助项目(2021A1515111167);广州市科技计划基础与应用基础研究资助项目(202102021235);

文章来源:付新亮,金少冰,杨明炜,等.猴耳环提取物对黄羽肉鸡肠道健康和肠道菌群的影响[J].中国兽医学报,2024,44(06):1239-1247.