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眼用盐酸洛美沙星壳聚糖纳米粒的制备与体外评价

2021-12-07 84 上传者：管理员

摘要：目的基于质量源于设计(QbD)理念制备盐酸洛美沙星壳聚糖纳米粒(LF-CNs),并评价其体外抗菌活性。方法采用离子凝胶化法制备LF-CNs,根据失效模式效应分析(FMEA)工具初步评估影响LF-CNs制剂性质的潜在处方和工艺变量,并通过2水平部分析因实验设计筛选出影响LF-CNs制剂性质的关键变量,最终以壳聚糖浓度、三聚磷酸钠(STPP)浓度和搅拌速度3个独立变量作为考察因素,以LF-CNs的粒径分布和包封率作为评价指标,应用Box-Behnken实验设计优化并得到LF-CNs的处方和制备工艺参数。通过ZetasizerNanoZS90动态激光粒度仪测定LF-CNs的粒径分布、聚合物分散性指数(PDI)和ζ电位,透射电子显微镜下观察LF-CNs的微观形态;采用体外透析法考察LF-CNs和LF原料药体外药物释放特性;通过抑菌实验比较LF原料药与LF-CNs的体外抑菌活性。结果经实验优化得到LF-CNs的最优处方和工艺参数:壳聚糖质量浓度为10mg/mL,STPP质量浓度为6mg/mL,搅拌速度为750r/min;在透射电镜下可观察到LF-CNs呈圆球状,无聚集,粒径大小为(479.6±18.7)nm,PDI为(0.194±0.012),ζ电位为(34.4±1.9)mV,LF-CNs的体外释放机制符合Korsmeyer-Peppas方程拟合,药物的释放为扩散和溶蚀双重机制;LF-CNs对金黄色葡萄球菌的体外抑菌效果优于LF原料药。结论将盐酸洛美沙星制备成壳聚糖纳米粒,处方设计科学合理,制备工艺简单易行,体外抑菌活性显著,有望成为盐酸洛美沙星眼用给药的一种有效途径。

关键词：
Box-Behnken实验设计
壳聚糖纳米粒
抑菌活性
盐酸洛美沙星
离子凝胶化法
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盐酸洛美沙星（LF）属于第三代的喹诺酮类抗生素，其通过抑制细菌的DNA螺旋酶的合成和复制而起杀菌作用，临床已证实LF对革兰阴性菌、阳性菌以及部分厌氧菌均有抗菌活性[1,2]，目前已将LF制备成滴眼液用于治疗细菌性结膜炎、角膜炎、角膜溃疡、泪囊炎、术后感染等外眼感染[3]。然而，患者在使用滴眼液后经常会出现频繁眨眼活动，导致大部分药物流失，治疗效果显著降低[4,5]。研究表明，生物黏附性聚合物会增加药物在眼部区域的停留时间，可提高药物治疗效果[6]。为此，本研究制备LF壳聚糖纳米粒（LF-CNs），为LF的眼部用药提供一种有效途径。

1、材料

1.1 主要仪器

安捷伦1200型高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；MYP19-2型恒温磁力搅拌器（上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司）；JEM-1011型透射电子显微镜（日本电子株式会社）；OptimaL-100XP型超速冷冻离心机（贝克曼库尔特商贸有限公司）；ZetasizerNanoZS90型激光粒度仪（英国马尔文公司）；纤维素透析袋（截留相对分子质量12000～14000，上海源叶生物科技有限公司）。

1.2 试药及主要试剂

LF原料药（郑州瑞康制药有限公司，批号20200214，质量分数为99.8%);LF对照品（中国食品药品检定研究院，批号130452-201603，质量分数99.4%）；壳聚糖（脱乙酰度为95%，相对分子质量范围为120000～150000，广州齐云生物技术有限公司）；三聚磷酸钠（STPP,Sigma试剂公司）；乙酸（AA,Sigma试剂公司）；纯净水由默克密理博Milli-Q纯水超纯水机制备。

2、方法与结果

2.1 LF-CNs的制备

LF-CNs采用离子凝胶化法制备，其原理是通过壳聚糖所带的NH3+（阳离子）基团与STPP中的PO4-（阴离子）基团通过静电作用并在外力作用下形成纳米级颗粒[7]。根据实验设计，在不同质量浓度（10、15mg/mL）的乙酸溶液中溶解不同质量浓度（5、10、15mg/mL）的壳聚糖，备用；另将LF原料药溶解到不同质量浓度（4、8、12mg/mL）的STPP溶液中；在不同搅拌速度（500、750、1000r/min）下将药物溶液缓慢滴加到壳聚糖溶液中，持续搅拌不同时间（30、90min）后，即得到LF-CNs溶液。

2.2 粒径分布测定

取LF-CNs溶液0.25mL在（25.0±0.5）°C下加入蒸馏水稀释10倍，使用ZetasizerNanoZS90型动态激光粒度仪测定粒径分布，所有样品均测定3次，取平均值。

2.3 包封率测定

取LF-CNs溶液1mL加入到25mL容量瓶中，加入质量浓度为50mg/mL的乙酸溶液使纳米粒完全溶解并定容，得到总待测样；另取LF-CNs溶液4mL,15000r/min离心30min，下层为纳米粒沉淀物，上层为澄清透明状溶液，吸取上清液1mL加入到25mL量瓶中并定容，得到游离待测样。取上述总待测样、游离待测样经HPLC法[8]检测药物含量（C总、C游离），计算LF-CNs的包封率。

2.4 基于QbD理念开发LF-CNs

2.4.1 风险识别

采用失效模式效应分析（FMEA）工具对可能影响LF-CNs制剂性质的潜在处方和工艺变量进行风险评估[9]，根据各个变量对LF-CNs制剂性质影响的严重性（S）、可能性（P）和可检测性（D）进行打分，将高风险定义为3分，中风险定义为2分，低风险定义为1分，风险优先数（RPN)=S×P×D，将RPN阈值设定为12分，RPN≥12分的变量被认定为是潜在的关键变量。

根据FMEA风险工具（图1）确定壳聚糖浓度、STPP浓度、乙酸浓度、搅拌速度和搅拌时间5个处方和工艺变量会对LF-CNs制剂性质具有潜在的影响，采用2水平部分析因实验设计筛选出关键变量。

2.4.2 2水平部分析因实验设计

使用Design-Expert10.1软件中的2-水平部分析因实验设计筛选出关键变量[10]，评估壳聚糖质量浓度（X1）、STPP质量浓度（X2）、乙酸质量浓度（X3）、搅拌速度（X4）和搅拌时间（X5）对LF-CNs的粒径分布（Y1）以及包封率（Y2）的影响，并基于半正态图（half-normalplot）和帕累托图（paretochart）对实验结果进行分析。表1列出了各个变量的低（-1）和高（+1)2个-水平，表2列出了16次实验设计及结果。

通过半正态图和帕累托图可以清晰地观察到影响LF-CNs的粒径与包封率的关键变量，如图2所示，壳聚糖质量浓度（X1）、STPP质量浓度（X2）和搅拌速度（X4）是影响LF-CNs的粒径大小的关键变量；同样如图3所示，壳聚糖质量浓度（X1）和STPP质量浓度（X2）是影响LF-CNs的包封率的关键变量。接下来通过Box-Behnken实验设计对关键性变量进一步优化。

2.4.3 Box-Behnken实验设计

固定乙酸质量浓度为10mg/mL，搅拌时间为30min，应用Box-Behnken实验设计进一步优化壳聚糖质量浓度（X1）、STPP质量浓度（X2）和搅拌速度（X3)3个关键变量对LF-CNs的粒径分布（Y1）和包封率（Y2）的影响。在此设计中变量设置为低（-1）、中（0）和高（+1)3个水平（表3），共进行了17次实验并得到相应的实验结果（表4）。

对LF-CNs的粒径分布和包封率的方差分析结果分别见表5、6,Y1和Y2模型的P值分别为<0.0001和0.0001，说明模型采用二次方程拟合较为适合；失拟项P值分别为0.2006和0.9229，均大于0.05，说明模型实测值与预测值之间不存在显著性差异，模型拟合可信度较高。通过软件生成的三维效应面图可以更为直观地分析变量因素与响应值之间的关系（图4、5）。

表5方差分析结果显示，壳聚糖质量浓度（X1）和STPP质量浓度（X2）对LF-CNs的粒径分布具有显著影响（P<0.05）。通过三维效应面图可知，壳聚糖质量浓度越高，制备的LF-CNs的粒径越大，可能是由于壳聚糖质量溶液浓度增加，黏度增大，不利于纳米粒的粒径减小[11]；随着STPP质量浓度的增加，制备的LF-CNs的粒径增大，这归因于STPP的质量浓度增加，可更多地与壳聚糖链上NH3+基团发生交联化反应，形成纳米粒的粒径较大[12]；搅拌速度（X3）对LF-CNs的粒径影响可以忽略不计。3个变量与粒径分布（Y1）之间的二次多项式拟合方程为：Y1=507.65-322.31X1-30.48X2-0.25X3+135.75X1X2-0.0056X1X3-0.14X2X4+308.93X12+58.80

表6方差分析结果显示，壳聚糖质量浓度（X1）与搅拌速度（X3）对LF-CNs的包封率有显著影响（P<0.05）。通过三维效应面图可知，随着壳聚糖质量浓度的增加，药物包封率增加，可能是由于壳聚糖质量浓度增高时，整个体系的黏度升高，药物更易于包裹在纳米粒中；搅拌速度提高会导致包封效率降低[13]。3个变量与包封率（Y2）之间的二次多项式拟合方程为：Y2=8.56+92.10X1-27.54X2-0.01X3-0.63X1X2-0.01X1X3+0.02X2X3-26.06

2.4.4 优化和验证

以制备的粒径最小和包封率最大作为LF-CNs制备目标，通过Design-Expert10.1软件预测获得LF-CNs的处方工艺设计空间，在设计空间内任选一点（壳聚糖质量浓度为10mg/mL,STPP质量浓度为6mg/mL，搅拌速度为750r/min，经软件预测得到的壳聚糖纳米粒的粒径470.3nm，包封效率56.3%。按照该处方工艺连续制备3批LF-CNs，测定粒径与包封率的实验值分别为（482.3±21.5)nm和（55.9±1.1）%，粒径与预测值之间的误差为2.49%，包封率与预测值之间的误差为-0.7%，均较小。

2.5 粒度分布、ζ电位和微观形态

根据“2.4.4”项下优化得到的处方工艺制备LF-CNs，并取LF-CNs溶液0.25mL用蒸馏水稀释10倍，通过ZetasizerNanoZS90动态激光粒度仪测定其粒径分布、聚合物分散性指数（PDI）和ζ电位，所有样品均测定3次，取平均值。另取LF-CNs溶液0.25mL用蒸馏水稀释100倍，取1滴放在覆铜的格栅上，用20mg/mL磷钨酸染色，滤纸吸取过量的水分，自然风干，在透射电子显微镜下观察LF-CNs的微观形态。

3批LF-CNs的粒径分布为（479.6±18.7)nm,PDI为（0.194±0.012），粒径小于1μm，可避免眼部给药引起不适感[14]；ζ电位为（34.4±1.9)mV，说明表面带有正电荷，这是因为壳聚糖纳米粒的表面氨基基团发生了质子化，其ζ电位值越大，越能够防止粒子之间聚集，物理稳定性越好[15]；另外，壳聚糖纳米粒表面所带的正电荷能够吸附到带负电荷的细菌表面，有利于增强抗菌活性[16,17]。透射电镜显示LF-CNs呈圆球状，无聚集，分散性良好（图6）。

2.6 体外释放研究

采用体外透析法考察LF-CNs和LF原料药的体外释放特性。将LF-CNs和LF水溶液分别装入处理好的透析袋中，绑紧两端。将透析袋浸入到人工泪液[18]的释放介质中，并以50r/min的速度搅拌，在1、2、3、4、6、8、12h取出2mL释放介质（补加空白介质）经适当稀释后，HPLC法[8]检测药物浓度，计算药物累计释放率。

LF-CNs和LF溶液的体外释放结果见图7,LF在2h内药物已释放完全，达到（99.4±3.2）%。而LF-CNs显示出双相释放模式，初始阶段显示为突释，药物在2h内释放量达到（43.9±2.6）%，此后表现为持续缓慢释放，最终在12h内释放量达到（83.4±3.5）%。初始阶段显示为突释，这是由于游离的和吸附在壳聚糖纳米粒表面的LF释放，而后期出现缓释，这是由于壳聚糖纳米粒内部药物缓慢释放。

释放数据分别采用零级、一级、Higuchi、Korsmeyer-Peppas方程拟合，探讨LF-CNs的释药机制，拟合方程中相关系数R2越接近1表明拟合效果越好，拟合方程见表7。模型拟合结果显示，LF-CNs释药符合Korsmeyer-Peppas方程，说明LF-CNs中的药物的释放为扩散和溶蚀双重机制。

2.7 体外抑菌实验

采用抑菌实验评价LF-CNs对金黄色葡萄球菌的体外抗菌活性。取金黄色葡萄球菌（浓度均为1×105CFU/mL）混悬液100μL均匀接种到铺有培养基的表面皿中，放入到培养箱中培养24h。在每份培养基上均取3个直径10mm的小孔，分别加入空白壳聚糖纳米粒、LF原料药、LF-CNs(LF原料药和LF-CNs中LF含量相同，均为6mg），做好标识，放到培养箱中培养24h，用游标卡尺测定抑菌圈直径，取平均值。实验重复3次。

抑菌实验结果显示，空白壳聚糖纳米粒对金黄色葡萄球菌具有一定的抑菌效果，抑菌圈直径为（11.9±0.8)mm，而LF原料药和LF-CNs抑菌效果均更明显，LF原料药的抑菌圈直径为（15.3±1.1)mm,LF-CNs的抑菌圈直径为（17.2±0.6)mm,LF-CNs对金黄色葡萄球菌产生的抑菌圈大于LF原料药，且差异显著（P<0.05）。结果见图8。结果表明，LF-CNs可提高药物的抑菌活性，一方面可能由于LF-CNs的粒径为纳米级，具有极大的比表面积，容易被细菌表面吸附，提高了药物与细菌的接触面积，增加了药物的抑菌活性；另一方面可能由于壳聚糖本身具有抑菌活性，将LF制备成壳聚糖纳米粒后达到了双重抑菌作用。

3、讨论

壳聚糖（chitosan）是将天然多糖甲壳素脱乙酰化而得的阳离子多聚糖，具有良好的生物相容性[19]和较强的生物黏附性[20]，可增强跨黏膜屏障的渗透性，并且延长药物与角膜的接触时间，提高药物的生物利用度[21]，更重要的是壳聚糖分子链中含有大量的NH3+基团，能够与细菌表面带负电荷的基团产生静电作用，吸附在细菌的细胞壁上，破坏细胞壁的完整性，增加通透性，有助于增强抗菌活性。已有研究表明，将壳聚糖作为抗菌药物载体制备成壳聚糖载药纳米粒，可以提高抗菌药物的抑菌活性[22]。因此，本研究选择壳聚糖作为载体材料将LF制备成壳聚糖纳米粒，并通过体外抑菌实验证实其抑菌效果优于其原料药。本研究制备的LF壳聚糖纳米粒，在眼部用药方面具有较大的应用价值，其能够有效地延长药物在感染处的作用持续时间，提高抗菌活性。本研究可为LF的眼部用药提供一种新的用药途径，也对同类型药物的二次开发起到一定的借鉴作用。

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文章来源：季可非,汪洋.眼用盐酸洛美沙星壳聚糖纳米粒的制备与体外评价[J].药物评价研究,2021,44(12):2627-2634.