裸花紫珠为马鞭草科植物裸花紫珠Callicarpa nudiflora Hook.et Arn.的干燥叶[1]，主要分布于我国海南、江西、广西等地，以海南五指山产者为上品[2]。该药具有收敛止血、消炎解毒的功效，可用于治疗细菌感染引起的急性传染性肺炎、消化道和呼吸道出血[3]。目前，研究者已从裸花紫珠中分离出300多种成分，主要为苯丙素类、挥发油类、黄酮类、倍半萜类、环烯醚萜类、三萜类、二萜类等成分[4]。

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus,RSV）是有包膜的单股负链RNA病毒，属单股负链病毒目肺病毒科，其基因组可编码11种蛋白[5]。中药具有多成分、多靶点的协同作用，可作用于多条通路，且不易产生耐药性，在治疗呼吸道病毒感染性疾病中具有广阔的应用前景[6]。已有文献报道，裸花紫珠乙酸乙酯部位是其抗单纯疱疹病毒（herpes simplex virus,HSV）的主要活性部位，可直接灭杀病毒，也可通过增强机体免疫来发挥抗HSV的作用[7]；裸花紫珠颗粒及裸花紫珠乙酸乙酯部位均具有较好的体外抗肠道病毒71型（human enterovi‐rus 71,EV71）的作用，治疗指数（therapeutic index,TI）分别为35.26、8.1[8,9]。

谱效关系研究可从中药指纹图谱和药效学研究出发，阐释中药发挥药效的物质基础[10]。本课题组前期研究证实，裸花紫珠醇提物对RSV有较好的抑制作用。虽已有研究建立了裸花紫珠的指纹图谱并报道了其抗病毒作用[7,8,9,11]，但其抗RSV作用的物质基础尚不明确。基于此，本研究拟首先建立20批裸花紫珠醇提物的超高效液相色谱（UPLC）指纹图谱，对其抗RSV的谱效关系进行研究，并建立数学模型表征裸花紫珠醇提物抗RSV的药效成分，以期为裸花紫珠的进一步开发利用提供实验依据。

1、材料

1.1主要仪器

本研究所用仪器包括Waters Acquity H-Class型UPLC系统（美国Waters公司）、Spectra Max M5型酶标仪（美国Molecular Device公司）、CKX41型倒置显微镜（日本Olympus公司）等。

1.2主要药品与试剂

4批裸花紫珠药材由江西普正药业股份有限公司提供，分别产自海南五指山（C1）、广西南宁（C2）、江西吉安锦源（C3）、江西吉安井冈山（C4），经江西普正药业股份有限公司吴永忠研究员鉴定均为马鞭草科植物裸花紫珠C.nudiflora Hook.et Arn.的干燥叶。

胎牛血清（批号10270-106）购自美国Clark公司；DMEM培养液（批号812207）、乙二胺四乙酸（EDTA)-0.25%胰酶（批号2323363）、磷酸盐缓冲液（PBS，批号BYHC1713）、青-链霉素双抗（批号HYT11280746）均购自美国Gibco公司；MTT试剂（批号1636C097）购自美国VWR公司；乙腈、乙酸均为色谱纯，二甲基亚砜（DMSO）等其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.3细胞与病毒

人喉鳞癌细胞Hep-2和RSV均由山东中医药大学中医药抗病毒平台提供。

2、方法与结果

2.1裸花紫珠醇提物指纹图谱的建立

2.1.1色谱条件

以Acquity UPLC BEH-C18(100 mm×2.1 mm,1.7μm）为色谱柱，以乙腈（B)-0.1%乙酸溶液（C）为流动相进行梯度洗脱（0～3 min,11%B;3～10 min,11%B→14.5%B;10～20 min,14.5%B→18%B;20～22 min,18%B→21%B;22～32 min,21%B→30%B;32～43 min,30%B→95%B）；柱温为35℃；流速为0.20 m L/min；检测波长为350 nm；进样量为2μL。

2.1.2裸花紫珠醇提物的制备

取4批裸花紫珠药材，粉碎；称取上述粉末各5份，每份40 g，分别加入10%、30%、50%、70%、90%乙醇400m L，超声提取45 min×2次，迅速抽滤，合并滤液，旋转蒸发回收溶剂后冷冻干燥，即得裸花紫珠醇提物样品S1～S20(C1～C4批药材的上述5种醇提物分别对应S1～S5、S6～S10、S11～S15、S16～S20，得率为10.52%～26.95%）。

2.1.3供试品溶液的制备

取上述20批裸花紫珠醇提物样品各0.1 g，精密称定，分别置于25 m L具塞容量瓶中，加50%甲醇溶解，超声至完全溶解，放冷后以50%甲醇定容，摇匀，经0.22µm微孔滤膜滤过，即得。

2.1.4方法学考察

(1）精密度考察：精密称取“2.1.3”项下供试品溶液（编号S3），按“2.1.1”项下色谱条件重复进样6次。以13号峰（保留时间适中、分离度良好且峰面积相对较大，下同）为参照峰，计算得各共有峰相对保留时间的RSD均不高于0.95%(n=6），相对峰面积的RSD均不高于2.86%(n=6），说明方法精密度良好。

(2）重复性考察：精密称取裸花紫珠醇提物样品（编号S3），共6份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样分析。以13号峰为参照峰，计算得各共有峰相对保留时间的RSD均不高于1.20%(n=6），相对峰面积的RSD均不高于3.42%(n=6），说明方法重复性良好。

(3）稳定性考察：精密称取“2.1.3”项下供试品溶液（编号S3），分别于室温静置0、2、4、8、12、24 h时按“2.1.1”项下色谱条件进样测定。以13号峰为参照峰，计算得各共有峰相对保留时间的RSD均不高于0.68%(n=6），相对峰面积的RSD均不高于3.12%(n=6），说明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定性良好。

2.1.5指纹图谱建立及相似度评价

取20批裸花紫珠醇提物样品各适量，采用“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图；将图谱信息导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》，以编号S3样品的图谱为参照，将时间窗宽度设为0.1 s，经多点校正自动匹配，生成叠加指纹图谱；经Mark峰匹配，最终确定了25个共有峰，并以中位数法生成了对照图谱（R），具体见图1。

图1 20批裸花紫珠醇提物样品的叠加指纹图谱和对照图谱 

2.1.6共有峰峰面积差异性分析

通过计算20批裸花紫珠醇提物样品指纹图谱各共有峰峰面积的RSD来进行差异性分析。结果显示，25个共有峰峰面积的RSD为33.54%～162.28%，其中峰2、6、9、14、24峰面积的RSD均超过90%，提示20批样品的成分含量有所差异，以峰2、6、9、14、24较为明显。

2.2裸花紫珠醇提物体外抗RSV的药效研究

2.2.1细胞复苏与培养

将装有Hep-2细胞的冻存管置于37℃水浴中，使其迅速复苏后转移至含DMEM培养液6 m L的无菌离心管中，以1 000 r/min离心3 min，弃去上清液；加入新鲜DMEM培养液10 m L，吹打后将细胞转移至细胞培养皿中，于37℃、5%CO2、75%相对湿度条件下培养；6 h后，更换培养液，继续培养，待单层细胞融合至80%后传代培养。

2.2.2病毒毒力测定

将Hep-2细胞以1.5×104个/孔接种于96孔板中，于37℃、5%CO2下培养12 h。RSV病毒液按10倍比用细胞维持液（即含2%胎牛血清的DMEM培养液，下同）稀释8个梯度（即1×10-8～1×10-1），加至长成单层的细胞中培养36 h（每个病毒稀释度设置6孔），采用致细胞病变效应（cytopathic effect,CPE）法观察病毒感染情况，按照Reed-Muench公式[12]计算得RSV的病毒滴度为3.4×107 TCID50/m L(TCID50为半数组织培养物感染量）。

2.2.3裸花紫珠醇提物细胞毒性及抗RSV活性测定

将20批裸花紫珠醇提物样品研细后分别溶于细胞维持液中，得质量浓度为1 mg/m L的供试药液。将Hep-2细胞以1.5×104个/孔接种于96孔板中，于37℃、5%CO2下培养12 h。将细胞分为空白对照组、模型对照组、药物组（裸花紫珠醇提物质量浓度分别为0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625、0.007 812 5 mg/m L，质量浓度按前期预实验结果设置），每组设置3个复孔。除空白对照组外，其余各组细胞均接种100个TCID50的病毒液（病毒加入量根据“2.2.2”项下结果设置），药物组细胞同时加入相应药液。培养36 h后，采用CPE法观察病毒感染情况，采用MTT法，以酶标仪于490 nm波长处检测各孔的光密度（OD）值来评估细胞活力，通过Graph Pad Prism 5软件拟合裸花紫珠醇提物对Hep-2细胞的半数毒性浓度（CC50）和对RSV病毒的半数抑制浓度（IC50），并计算TI值（TI=CC50/IC50)[13,14]。上述实验平行2批进行，1批用于拟合CC50,1批用于拟合IC50。

结果（表1）显示，随着提取溶剂极性的减小，裸花紫珠醇提物的细胞毒性有逐渐增强的趋势，其中S10样品的细胞毒性最强，CC50为（87.03±6.85）μg/m L。20批裸花紫珠醇提物对RSV有不同程度的抑制作用，其中S10样品的抗RSV活性最强，其IC50为（9.55±1.35）μg/m L;S15样品的抗RSV活性次之，其IC50为（11.07±1.16）μg/m L;S2样品的TI值最大，为27.53;S11样品的TI值最小，为3.63。

2.3裸花紫珠醇提物抗RSV活性的谱效关系评价

2.3.1 Pearson相关性分析

采用SPSS 22.0软件，对裸花紫珠醇提物指纹图谱的共有峰峰面积与IC50进行Z-score标准化处理，采用Pearson相关性分析对二者的关系进行评价。结果（表2）显示，峰8、10、12、16、18～19、22～24的峰面积与IC50呈负相关，相关系数分别为-0.573、-0.731、-0.523、-0.531、-0.497、-0.452、-0.497、-0.595、-0.619(P<0.05或P<0.01）。可以推测，这9个共有峰对应成分可能与裸花紫珠醇提物的抗RSV活性有关，且其峰面积越大，裸花紫珠提取物的IC50越小，抗RSV活性可能越强。

表1 20批裸花紫珠醇提物样品的CC50及抗RSV的IC50、TI值（x±s,n=3) 

表2各共有峰峰面积与IC50的Pearson相关系数 

2.3.2灰色关联度分析

灰色关联度分析能进一步反映各化学成分对药效的贡献[15]，故本研究以20批裸花紫珠醇提物的IC50作为母序列[记为X0(i)(i=1,2，……，20）]，以各批裸花紫珠醇提物指纹图谱的25个共有峰峰面积作为子序列[分别记为X1(k)～X25(k)(k=1,2，……，20）]，采用归一化法对数据进行无量纲化处理后，再根据灰色关联度分析方法计算峰面积与IC50的关联度。结果（表3）显示，裸花紫珠醇提物指纹图谱各共有峰对抗RSV活性贡献最大的为峰1，最小的为峰24;25个共有峰的关联度均大于0.6，提示25个共有峰所对应的化学成分与药效学指标均具有关联性[16]。

2.3.3 OPLS分析

采用SIMCA 14.0软件，以裸花紫珠醇提物指纹图谱的25个共有峰峰面积为自变量（X1～X25），以其抗RSV的IC50为因变量（Y），进行正交偏最小二乘（orthogonal partial least squares,OPLS）分析，得标准化回归方程和变量重要性投影（variable importance in projection,VIP）值。

表3各共有峰峰面积与IC50的关联度 

其中，方程的回归系数可反映各自变量对抗RSV活性（即IC50）的贡献大小[17]。本研究得标准化回归方程为Y=0.087 4X1+0.029 9X2-0.002 6X3+0.000 8X4+0.036 4X5+0.022 5X6-0.014 5X7-0.116 4X8-0.056 2X9-0.119 0X10-0.055 3X11-0.119 8X12-0.025 0X13-0.061 0X14-0.019 3X15-0.082 5X16-0.082 1X17-0.064 8X18-0.055 4X19-0.076 0X20-0.044 2X21-0.051 3X22-0.084 4X23-0.097 3X24+0.000 3X25。由此方程可知，峰3、7～24对应的回归系数均为负值，提示其对应成分与IC50呈负相关[17]。

VIP可解释自变量对因变量的贡献程度，其值越大，说明该自变量对因变量的贡献越大，若其值大于1则表示对该因变量有显著贡献[17]。结果（图2）显示，25个共有峰中，峰10、24、23、22、8、12、18、1、19、20、16的VIP值均大于1，表明其对应成分对裸花紫珠抗RSV活性具有显著影响。

图2各共有峰的VIP值  

3、讨论

3.1裸花紫珠醇提物的UPLC指纹图谱

本研究首先建立了裸花紫珠不同醇提物的指纹图谱。结果显示，20批裸花紫珠醇提物指纹图谱的相似度为0.912～0.998，共有峰峰面积的RSD为33.54%～162.28%，提示各醇提物的化学成分相似，但含量有所差异。

3.2裸花紫珠醇提物的体外抗RSV活性

本研究以Hep-2细胞为对象，对裸花紫珠不同醇提物的体外抗RSV活性进行了评价。结果显示，随着提取溶剂极性的减小，裸花紫珠醇提物的细胞毒性有增强的趋势，其中S10样品的细胞毒性最强；20批裸花紫珠醇提物中，S10样品的IC50值最小，S15样品次之；S2样品的TI值最大，S11样品最小。这提示，各批醇提物对RSV有不同程度的体外抑制作用。

3.3裸花紫珠醇提物抗RSV活性的谱效关系

数学模型为中药药效成分筛选提供了分析手段，但每种模型都有自身的局限性；同时，相同的数据使用不同的处理方法也可能会得到完全不同的结果[18]，故本研究采用了Pearson相关性分析、灰色关联度、OPLS分析，以综合评价裸花紫珠醇提物抗RSV活性的谱效关系。其中，Pearson相关性分析可评价2个变量相关联的程度，并能反映关联度的方向（正相关、负相关），但无法体现其他变量的影响，故不能评估多种成分的整体作用[15]。灰色关联度分析方法能评估成分对药效的贡献，但无法描述各成分对药效的综合贡献度和关联度方向[19]，因此在该法基础上联合OPLS分析可进一步明确呈正、负相关的药效成分[20,21]。

综合上述3种分析方法，本研究以Pearson相关系数为负值（P<0.05）、关联度大于0.6、OPLS模型回归系数为负值且VIP值大于1的共有峰作为特征峰[16,17,22]，其相对应的化合物即为对药效有较大贡献的特征成分。Pearson相关性分析结果显示，峰8、10、12、16、18～19、22～24的峰面积与抗RSV药效指标IC50的Pearson相关系数均为负值（P<0.05）；灰色关联度分析结果显示，25个共有峰峰面积与抗RSV药效指标IC50的关联度均大于0.6;OPLS分析结果显示，峰8、10、12、16、18～20、22～24的回归系数为负值且VIP大于1。综合上述结果可知，峰8、10、12、16、18～19、22～24的峰面积与抗RSV药效指标IC50呈负相关，其对应成分可能是裸花紫珠醇提物抗RSV的特征成分。

综上所述，本研究成功建立了裸花紫珠不同醇提物的UPLC指纹图谱，各醇提物成分一致性较好，但含量有所差异；各醇提物具有不同程度的抗RSV活性，其中峰8、10、12、16、18～19、22～24对应成分可能是其抗RSV的特征成分。本研究基于中药谱效学研究，将成分的“量”与“效”相结合，挖掘出了能反映中药发挥药效的活性成分，可为裸花紫珠的质量标志物筛选及质量控制提供参考。

参考文献:

[1]国家药典委员会中华人民共和国药典: -部[M]2020年版北京:中国医药科技出版社,2020:378-379.

[2]彭云露黎药裸花紫珠资源品质差异及转录组学研究[D]海口:海南医学院,2021.

[3]康兴东,叶阳裸花紫珠化学成分､药理活性及临床应用研究进展[J].特产研究,2021.43(4):95-101.

[6]忠,陈寅萤,张盈颖,等多组分多靶点中药药理作用机制研究中的问题和解决策略[J].中国实验方剂学杂志,2018,24(5)-:1-6.

[7]周芹芹裸花紫珠抗单纯疱疹病毒I型药效物质基础研究[D].济南:济南大学, 2017.

[8]范路路,田景振,耿巧玉,等.裸花紫珠颗粒体外抗肠道病毒71型及幽[ ]螺杆菌的活性研究[J].山东中医杂志, 2018,37(10)-851-855.

[9]杨颖,邵骏菁,温柔,等.裸花紫珠乙酸乙酯部位人工胃肠液处理前后化学成分及抗EV71活性研究[J]中华中医药杂志,2022 ,37(5):2769-2773.

[10]张强,杨宇婷中药谱效关系研究现状概述[J]时珍国医国药,2022,33(3):680-683.

[11]邓杰仁,杨义芳,李小锋,等裸花紫珠UPLC指纹图谱的建立[J].中成药,2020 ,42(7):1926- 1930.

[12]耿子凯经方葛根汤抗甲型H1 N1流感病毒的作用机制及药效物质研究[D].济南:山东中医药大学,2019.

基金资助:山东省重点研发计划(重大科技创新工程)项目(No.2021CXGC010511,No.2020CXGC010505);

文章来源:邵冰梅,李小锋,闫蓓蓓等.裸花紫珠醇提物UPLC指纹图谱建立及抗呼吸道合胞病毒谱效关系研究[J].中国药房,2023,34(20):2465-2470.