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基于巯基-烯点击化学法的叶黄素亲水性修饰实验

2020-07-01 562 上传者：管理员

摘要：摘要：叶黄素是一种含氧的类胡萝卜素,适量摄入叶黄素可以减少白内障的发生,叶黄素还可以调节人和动物的免疫能力并且具有预防癌症的作用,但是,叶黄素的低水溶性限制了其在食品和制药行业中的应用。本文研究了利用巯基-烯点击化学法对叶黄素进行亲水性修饰,为叶黄素的化学改性提供了一种新方法。首先以三乙胺为缚酸剂,使叶黄素与丙烯酰氯酯化反应得到两端以乙烯基为端基的中间体,再在紫外光照射下以2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮为催化剂,使中间体与L-半胱氨酸通过巯基-烯点击化学反应在叶黄素的两端引入亲水性的氨基和羧基,得到两亲性叶黄素。通过UV、IR对产物进行表征,结果表明成功合成了两亲性叶黄素,通过TEM观察两亲性叶黄素在水中自组装形成球形胶束,平均粒径为85nm,有望会大大增加叶黄素在生物体内的吸收率。

关键词：
亲水性修饰
半胱氨酸
叶黄素
巯基-烯点击化学
有机化学
自组装
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1、引言

叶黄素是一种含氧的类胡萝卜素，其分子结构的碳骨架由中央多聚烯链和位于两侧的芳香环组成，并在每个芳香环上各有一个羟基。叶黄素主要来源于万寿菊及其他高等植物的花瓣、叶茎中[1,2]。作为一种天然的抗氧化剂，叶黄素具有较强的淬灭自由基的能力，能清除自由基和游离基，限制由于新陈代谢和光线所致的组织损伤，能作为一种抗氧化剂保护眼底黄斑，减少可见光波段造成的损伤，有效的预防黄斑变性和白内障的发生[3,4,5,6]。目前，叶黄素被制成多种药品、营养补充品、保健食品和功能食品，被人体利用[7,8]。但是由于叶黄素分子较长的亲油链，在水中溶解度极低，所以生物利用度很低；且遇光、热、酸不稳定，易氧化和降解，使得对叶黄素的加工变得困难，限制了叶黄素的应用[9,10]。许多技术已被应用于改善叶黄素的性质，例如，通过纳米封装制备叶黄素的纳米胶囊[11]、多层叶黄素乳剂的制备[12,13]。与游离叶黄素分子相比，叶黄素酯具有更高的生物利用度和更高的储存稳定性[14]。但是使用传统化学方法对叶黄素进行改性，存在反应条件苛刻、不利于叶黄素稳定的缺点，巯基-烯的点击化学为叶黄素的化学改性、有效提高生物利用度提供了另一种途径。

点击化学的主旨是通过小单元的拼接，在温和的条件下高选择性的、快速可靠的完成各种分子合成[15]。最常用的反应为铜催化的叠氮-炔基环加成反应，但此反应用到的叠氮化物为危险品，并且产物中容易残留重金属离子[16,17,18]。相比之下巯基-烯的光化学反应，反应条件更加适合对叶黄素的改性[19,20,21]。

本研究采取紫外光催化的巯基-烯点击化学法对叶黄素进行亲水改性，用丙烯酰氯与叶黄素反应制备乙烯基封端的叶黄素分子，通过半胱氨酸上的巯基和叶黄素端基的乙烯基点击化学反应，将氨基和羧基引入到叶黄素分子的端基上，增加叶黄素的亲水性，得到两亲性的叶黄素，并研究了其在水溶液中的自组装。

2、实验部分

2.1实验材料

叶黄素（90%）由山东天音生物科技有限公司提供；丙烯酰氯（AR）、半胱氨酸（99%）和2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮（99%）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三乙胺（99%）、二氯甲烷（AR）和氢氧化钠（AR）购自烟台市双双化工有限公司；三次蒸馏水实验室自制；四氢呋喃（AR,THF）购自天津市广成化学试剂有限公司，用前氢化钙干燥回流蒸馏。其他试剂用前未做任何处理。

2.2端乙烯基叶黄素的合成

在三口烧瓶中加入50mLTHF，并在氩气保护下加入0.5g(0.878mmol）叶黄素，待完全溶解后加入0.19g(2.109mmol）丙烯酰氯，搅拌使其混合均匀，再加入0.212g(2.095mmol）三乙胺，密封反应瓶，避光室温反应9h。减压蒸馏除去THF，将粗产物溶解在二氯甲烷中，用蒸馏水洗涤，分液，收集有机相，反复三次，除去三乙胺及其盐。蒸馏除去二氯甲烷，真空干燥，得到固体产物0.3714g，产率为62.2%。置于氩气保护下的密封避光容器中保存。

2.3点击化学法合成两亲性叶黄素

在氩气保护下，在三口烧瓶中加入0.3710g(0.55mmol）端乙烯基叶黄素，加入30mLTHF使其溶解，并加入催化剂2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮0.0105g(0.039mmol），搅拌使其完全溶解。将0.1341g(1.101mmol）半胱氨酸溶于10mL水中，使用恒压漏斗将半胱氨酸的水溶液缓慢滴入端乙烯基叶黄素中，同时在紫外灯照射下搅拌反应20min。减压蒸馏除去溶剂THF，将反应产物溶解在二氯甲烷中，用蒸馏水分液洗涤三次后除去二氯甲烷，真空干燥后，得红色固体0.3356g，产率为70.1%。并所得产品置于氩气保护下的密封避光容器中保存。

2.4两亲性叶黄素分子的自组装

将5mg两亲性叶黄素溶解在5mL乙醇中，在剧烈搅拌下，将其缓慢滴加到30mL(pH=8.0）的氢氧化钠水溶液中，再搅拌10min，减压除去乙醇，得自组装溶液。

2.5表征

叶黄素、端乙烯基叶黄素以及两亲性叶黄素经过溴化钾压片制样，在岛津8400S傅立叶红外光谱仪上测定了傅立叶变换红外光谱。采用TU-1901紫外/可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）以乙醇作为参比液，记录叶黄素和两亲性叶黄素的紫外光谱。采用JEOLJEM-2000EXII型透射电子显微镜，加速电压为200KV，对两亲性叶黄素的自组装形貌进行观测，制样方法为：取两亲性叶黄素的水溶液滴于覆有镀碳膜的铜网上，自然风干3h后，真空干燥10h。

3、结果与讨论

3.1两亲性叶黄素合成

首先以三乙胺为缚酸剂，使叶黄素与丙烯酰氯反应得到以乙烯基为端基的中间体，再在紫外光照射下以2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮为催化剂，使中间体与L-半胱氨酸点击化学反应得到两亲性叶黄素分子。合成路线如图1所示。整个合成过程中需要惰性气体保护，以避免叶黄素被空气中的氧气氧化。

图1两亲性叶黄素的合成路线

图2为叶黄素（a）、端乙烯基叶黄素（b）及两亲性叶黄素分子（c）的红外光谱图。曲线b中，在1724cm-1处出现较强的C=O的伸缩振动峰，并且位于3428cm-1处的-OH吸收峰明显减弱，表明叶黄素已与丙烯酰氯反应成功得到端基为乙烯基的中间体。两亲性叶黄素的红外光谱曲线中，3428cm-1的振动峰增强，归属于-NH2的伸缩振动峰，表明L-半胱氨酸已与中间体反应得到两亲性叶黄素。

图3为两亲性叶黄素分子（a）及叶黄素（b）的UV-Vis谱图。从图中可知，在波长为446nm、470nm处的叶黄素的特征峰，在两亲性叶黄素的紫外光谱中仍然存在，且在相同浓度下，吸光度变化不明显，证明叶黄素的结构在反应过程中并没有被破坏。

3.2两亲性叶黄素的自组装

叶黄素经半胱氨酸修饰以后，端基上同时引入亲水性的-COOH和-NH2，使得叶黄素的亲水性大大增强，中间是具有疏水性的叶黄素分子链结构，因此具有两亲性。在碱性水溶液中，羧基转化为羧酸盐，更增加了水溶性。图4(a）为两亲性叶黄素在水中的照片，可以看出在弱碱性水溶液中，所得两亲性叶黄素呈稳定的透明溶液，无任何固体析出；（b）为相同质量浓度的叶黄素在碱性水溶液中的状态，可以看出叶黄素溶解度很低，有固体析出。表明所得半胱氨酸修饰的叶黄素的亲水性比叶黄素好的多。

图2叶黄素（a）、中间体（b）、两亲性叶黄素分子（c）的红外图谱

图3两亲性叶黄素分子（a）及叶黄素（b）的UV-Vis谱图

图4两亲性叶黄素水（a）和叶黄素（b）的水溶液

图5是两亲性叶黄素在水溶液中TEM图片。可以看出两亲性叶黄素在水溶液中自组装形成球形胶束，胶束的平均尺寸约为85nm。因为其两亲性结构，将大大增加在生物体中的吸收效率。

图5两亲性叶黄素囊泡透射电镜照片

4、总结

采用巯基-烯点击化学法合成了两亲性叶黄素分子，中间体端乙烯基叶黄素和两亲性叶黄素分子的产率分别为62.2%和70.1%。在合成过程中叶黄素分子结构并没有被破坏，证明巯基-烯点击化学法可以应用于叶黄素分子的改性中。由于两亲性叶黄素分子是两端含有亲水基团、中间是具有疏水性的叶黄素分子链的结构，所以在水中自组装成球形胶束，这也使得两亲性叶黄素在水中拥有较好的溶解性，可以大大提高在生物体内的吸收利用率。整个合成过程简单温和，为叶黄素，也为其他类胡萝卜素的化学改性开创了一条新的途径。

参考文献：

[19]刘清,张秋禹,陈少杰,等.巯基-烯/炔点击化学研究进展[J].有机化学,2012,32(10):1846-1863.

王飞,张纳,蔡昌辰,陈玉静,李爱香,宋新华,刘温来.巯基-烯点击化学法合成两亲性叶黄素[J].中国食品添加剂,2020,31(05):53-57.

基金:山东省自然科学基金(ZR201808130106).