泪液是一种由泪腺､结膜杯状细胞分泌的透明稍带乳白色的水样液体,具有冲刷､润滑､营养､屈光､杀菌､免疫及调节等作用[1]｡人体分泌的泪液成分复杂,含有丰富的生理和病理信息,泪液成分的变化与一些眼科疾病的发生发展密切相关[2]｡此外,泪液容易获取且方式安全无创,通过对泪液成分和功能的检测确定某些疾病发展的关键通路,为预防及治疗提供了一种新的可能[3]｡因此,近年来越来越多的研究投入于泪液采集与成分检测中,以期研发出更安全､无创､高效的疾病诊查技术,从而更好地对眼科疾病进行诊断和预防｡本文对现有泪液采集方法､泪液检测技术以及泪液检测目前可以诊断的眼科疾病进行综述,现报道如下｡

1、泪液采集方法

泪液按分泌方式可分为基础性泪液分泌､反射性泪液分泌及情绪性泪液分泌3种类型｡在临床上,为避免对疾病诊断的干扰,只采集基础性分泌泪液进行成分分析｡以下介绍3种目前已投入临床使用的基础性泪液采集方法｡

1.1传统泪液采集方法

1.1.1Schirmer试纸收集法是粗略检测泪液分泌量的传统测量方法,也是最常用的干眼检测方法之一,在眼科临床被广泛应用[1]｡其通过滤纸吸附泪液5min,测量湿润长度得到Schirmer值,操作简便｡缺点是可能诱发反射性泪液分泌,得到偏倚结果｡

1.1.2玻璃微毛细管收集法利用毛细作用收集泪河泪液,可减少刺激,这种方法被认为是避免反射性泪液分泌的最佳方法,但对操作者技术要求高,耗时且不适用于泪液量极低的患者｡

1.1.3眼海绵收集法通过外置海绵吸收泪液,标准化程度高,但细胞因子可能被海绵吸附,且存在反射性泪液污染风险[4]｡

1.2新兴泪液采集手段

1.2.1眼表点触眼表点触(preocularcontacttip,PCT)是将不同接触面积的尖端采集器,放置于结膜囊下穹隆进行触压约10s,可获得约0.3mL的泪液｡优点是对眼表组织损伤小､恢复快,且能最大程度避免反射性泪液分泌;缺点是目前采集泪液的速率还不够高,因此难以得到广泛运用[1]｡

1.2.2条状半月板测量管SHINZAWAM等[5]用条状半月板测量管(stripmeniscometrytube,SMTube)采集泪液,这是一种特殊吸水材料,由人造丝和纸浆构成,基于吸水材料快速(5s)评估泪液量,蓝色染色长度与泪液体积呈正相关,适用于干眼筛查｡研究[6]显示,湿润长度<5mm/5s提示泪液缺乏｡该采集方式在干眼的诊断中用于排除无泪液缺乏的患者具有较大意义[7]｡

2、泪液检测技术

2.1常用泪液检测技术

2.1.1泪液蕨类试验已成功应用于区分干眼患者和健康人群[8],也可用于区分Sjögren's综合征患者和健康人群[9]｡TABBARAKF等[11]率先报道了使用泪液蕨类试验(或称泪液析晶形态试验)为眼部缺乏泪液的定性检测方法,发现在各种急性结膜炎患者中,有91%的患者出现了泪液蕨类样形态异常;而在弥漫性结膜糜烂的患者中,泪液蕨类样图形明显缺失｡这些结果表明,泪液蕨类试验可作为一种简单而廉价的测试方法,用于临床评估眼部疾病｡

2.1.2非侵入式泪河高度测量传统荧光素染色法因直接接触眼表,易引发反射性泪液分泌,造成假阴性结果,而非侵入式泪河高度测量技术(non-invasivetearmeniscusheight,NITMH)可以避免由于刺激眼表引发的反射性泪液分泌,优于传统方法｡如非接触式眼表综合分析仪基于红外成像技术,将泪河高度(tearmeniscusheight,TMH)检测阈值精确至0.20mm[12]｡SMTube凭借5s快速接触取样技术,能实现对TMH的快速定量分级[13-14]｡

2.1.3泪液分泌试验主要包括Schirmer试验､酚红棉丝试验､泪液功能指数和荧光素清除试验｡SchirmerⅠ试验无需进行表面麻醉,反映生理性泪液分泌[15];而SchirmerⅡ试验则需要进行表面麻醉,反映基础泪液分泌[16]｡Schirmer试验在使用上缺乏一致性,在这种情况下,研究者对其进行了各方面的改进｡SAKAMOTOR等[17]将Schirmer试纸换作酚红棉丝进行试验,发现其较SchirmerⅠ试验的优点在于对患者的刺激较小､准确度较高,且可作为SchirmerⅠ试验的补充检查方法,以提高诊断的准确性｡此外,泪液功能指数和荧光素清除试验均被看作是与泪液清除率结合的Schirmer改良试验[20-21],它们在干眼诊断的准确性方面有所提高,但由于耗时长和刺激性大而难以被广泛应用｡

2.1.4泪膜检测包括泪膜稳定性的检查和泪膜脂质层厚度的测量｡临床常用泪膜破裂时间(tearfilmbreak-uptime,BUT)反映泪膜的稳定性,指末次瞬目至角膜出现首个破裂点的时间｡目前,BUT的主要测量方法分为荧光素泪膜破裂时间(fluoresceintearfilmbreak-uptime,FBUT)和非侵入式泪膜破裂时间(noninvasivetearfilmbreak-uptime,NIBUT)2类测量方法｡由于FBUT易受荧光素钠和温度､湿度､空气等环境因素影响,且NIBUT对眼表的干扰和影响更小,故NIBUT在临床当中被更多使用｡

2.2新兴泪液检测技术

2.2.1高效液相色谱-质谱法联用高效液相色谱-质谱法联用(highperformanceliquidchromatography-massspectrometry,HPLC-MS)又称液相色谱-质谱联用技术,以液相色谱作为分离系统,质谱为检测系统｡样品在质谱部分和流动相分离,被离子化后,经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开,经检测器得到质谱图｡近年来,已有相关研究[20,24]基于HPLC-MS测定眼科局部给药､口服给药后泪液中的外源性药物浓度｡

2.2.2纸喷雾电离质谱姚亚男等[2]采用Schirmer试纸采集泪液,并结合纸喷雾电离质谱(paperspraymassspectrometry,PSMS)技术,构建Schirmer-PSMS分析方法,实现了人体泪液的安全无创采集与直接质谱分析｡该方法泪液消耗量低至1.0µL,实现了在无需预处理样品的条件下,可以快速获取人体泪液中代谢物及化学残留物的定性与定量信息,具有分析速度快､灵敏度高､特异性优异和操作便捷的优点[2]｡

2.2.3高性能泪液快速免疫检测我国广东某公司开发建立了一个高灵敏度､高精确度､特殊条件的高性能泪液快速免疫检测(point-of-caretesting,POCT)平台[22],其通过操作简便的泪液收集装置,应用免疫层析原理,可快速检测泪液中标记物的含量｡从收集泪液到获得检测结果只需10min左右,无需仪器,结果直观｡

2.2.4iTEARSHUL等[23]报告了使用纳米技术通过快速隔离系统(integratedtearexosomeanalysisviarapid-isolationsystem,iTEARS)进行的泪液外泌体分析,以发现眼部疾病和全身性疾病的关系｡通过基于纳米多孔膜的谐振器,在5min内从0∼10µL泪滴中快速分离出高产量和高纯度的外泌体,用于蛋白质组学和转录组学分析,进行生物标志物的定量检测｡利用这一技术,该团队成功从干眼患者的外泌体中锁定3种特异性蛋白:钙调蛋白样蛋白5(calmodulin-likeprotein5,CALML5)､角蛋白6A(keratin6A,KRT6A)､S100钙结合蛋白P(s100calciumbindingproteinP,S100P),为干眼诊断提供了新标志物｡同时发现了4种与糖尿病视网膜病变(diabeticretinopathy,DR)相关miRNA的失调,分别为miR145-5p､miR-214-3p､miR-218-5p和miR-9-5p,这些都表明泪液可间接反映全身性疾病进展｡该研究[23]证实,iTEARS可用于通过泪液的分子诊断,以识别眼部疾病､全身性疾病以及许多其他神经退行性疾病和癌症｡

2.2.5眼表综合分析仪兼具NIBUT､TMH､脂质层厚度､角膜染色､不完全眨眼分析､睑缘拍照､睑板腺红外拍照､眼红分析､角膜直径距离分析(white-to-whitedistance,WTW)､眼表疾病指数量表(ocularsurfacediseaseindex,OSDI)评分等十余项检测指标,能够综合诊断干眼[24]｡其通过高清晰图像和人工智能分析,将睑脂､睑缘及睑板腺等眼部特征清晰显现,并加以特定标识进行区分,这对诊治眼表疾病具有重要的作用,可为眼科医生提供一种可靠性较高的干眼诊断方式,提高眼表疾病诊断的准确率｡

3、泪液检测与眼科疾病

3.1目前泪液检测可诊断的眼科疾病

3.1.1干眼泪液蛋白质组学在干眼研究中得到了越来越广泛的应用,韦庆波等[25]将蛋白质组学技术应用于针刺治疗干眼的研究,不仅可从不同病因病程揭示干眼蛋白质水平的动态变化,寻找潜在生物标志物,还能系统挖掘针刺治疗干眼的调控机制,为针刺治疗的理论研究和基础研究提供依据｡沈天宜等[26]使用针刺治疗绝经后期干眼患者,分析其有效性及其分子机制｡该研究选取28例患者(56只眼),采集治疗前后各组泪液样本,采用二维纳米液相色谱耦合串联质谱法对泪液进行蛋白质组学分析,蛋白质印迹法比较2组泪液蛋白差异｡结果显示,针刺联合人工泪液治疗增加了绝经后期干眼患者泪液蛋白质的合成及分泌,改善干眼症状｡HUL等[23]利用纳米技术通过iTEARS进行干眼患者泪液外泌体分析,检测到了426种蛋白质,并证明了CALML5､KRT6A和S100P可以用于干眼的分类｡ZHANGT等[27]应用基于质谱的策略分析泪液和细胞外囊泡(extracellularvesicles,EV)的肽组/蛋白质组图谱,从而进行快速干眼诊断｡该研究从健康对照个体和干眼患者的眼泪中各自分离出纳米细胞外囊泡,并通过基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱追踪其指纹,进一步分析泪液成分,为筛选干眼潜在的生物标志物提供了一种快速､有效的方法｡

杜垚磊[28]与吴欢欢[29]对受试者进行泪液α-淋巴毒素(lymphotoxin-alpha,LTA)水平检测及结膜杯状细胞密度检查,并应用干眼问卷[30]､裂隙灯显微镜､Keratograph眼表综合分析仪及泪液分泌试验等检查,发现泪液LTA浓度与结膜杯状细胞密度有正相关性,泪液LTA在评估泪膜的稳定性和干眼诊断中有一定价值｡

3.1.2青光眼TAMKOVICHS等[31]通过透射电子显微镜比较原发性开角型青光眼(primaryopenangleglaucoma,POAG)患者和健康人群泪液的上清液和沉淀液｡结果显示,POAG患者泪液颗粒基因组ds-DNA和短散在核元件(shortinterspersednuclearelement,SINE)重复序列的浓度高于健康人群,miR-146b､miR-16和miR-126以及一组不同细菌DNA的表达也有差异,表明泪液可用于POAG的诊断｡ROSSIC等[32]通过多组学方法发现,未接受过治疗的POAG患者的某些泪液氨基酸和溶血磷脂水平低于正常人群,靶向分析显示POAG患者中乙酰基-L-肉碱(acetyl-l-carnitine,ALCAR)的含量较正常人群低｡

3.1.3视网膜疾病蒋佳倩等[33]通过随机收集玻璃体切除手术(parsplanavitrectomy,PPV)患者30例,其中增殖性DR患者15例为PDR组,非DR患者15例为对照组｡对比2组患者手术前后相关数据,发现PPV治疗增殖性DR术后患者泪膜稳定性下降,出现角膜上皮损伤,泪液中神经肽P物质(substanceP,SP)和降钙素基因相关肽(calcitoningenerelatedpeptide,CGRP)浓度低于对照组｡HUL等[23]利用iTEARS技术进行分析泪液外泌体中的484个miRNA,结果显示,miR-145-5p､miR-214-3p､miR-218-5p和miR-9-5p在DR发展过程中失调｡李钦恒等[34]发现,DR患者的病变情况与泪液TNF-α具有相关性,泪液TNF-α可以作为DR患者诊断及病情评估的指标｡

3.1.4甲状腺相关性眼病甲状腺相关性眼病(thyroidassociatedophthalmopathy,TAO)是由自身免疫反应引起的慢性致盲性眼部疾病,其与甲状腺功能障碍密切相关｡张浩等[35]综述发现,泪液中与TAO相关的分子生物标志物包括8-羟基-2-脱氧鸟苷､丙二醛､钙结合蛋白A4､催乳素诱导蛋白､外泌体蛋白､溶菌酶4等｡HANJS等[36]通过分离TAO患者的泪液中的外泌体并分析,发现外泌体蛋白包括维生素D结合蛋白(vitaminDbindingprotein,VDBP)､C反应蛋白(Creactiveprotein,CRP)､几丁质酶3样1(chitinase3-like1,CHI3L1)､基质金属蛋白酶-9(matrixmetalloproteinase-9,MMP-9)和血管黏附分子-1(vascularcelladhesionmolecule1,VCAM-1)､白细胞介素(interleukin,IL)-6､IL-8和单核细胞趋化蛋白-1(monocytechemoattractantprotein-1,MCP-1)可能在TAO的发病机制中发挥关键作用｡3.1.5白内障许衍辉等[37]从15例高度近视性白内障(highmyopiacomplicatedbycataract,HMC)患者和15例年龄相关性白内障(age-relatedcataract,ARC)患者中收集泪液样本,应用16sRNA高通量测序技术分析微生物DNA,并结合非度量多维尺度分析和主成分分析对微生物群落多样性进行评估,使用置换多元方差分析对2种类型白内障患者的泪液微生物组成进行比较,得出HMC和ARC患者的泪液微生物组成存在差异的结论,这可能与2种白内障不同的病理过程有关｡黄祥平等[38]检测131例白内障患者术前､术后的泪液中IL-1β､IL-6､TNF-α水平,发现白内障患者术后泪液中IL1β､IL-6及TNF-α水平显著升高,是不良临床事件发生的主要危险因素,三者联合检测可为临床评价不良事件发生风险提供参考,便于早期干预｡

3.1.6角膜炎角膜位于眼球最前面,直接与外界接触,易受到微生物､外伤及理化刺激因素的损害而发生炎症｡各种因素导致的角膜炎症反应统称为角膜炎,是眼科常见疾病之一,也是我国主要致盲眼病之一｡李萍等[39]发现,过敏性结膜炎(allergicconjunctivitis,AC)患儿血清､泪液中透明质酸(hyaluronicacid,HA)､胸腺基质淋巴细胞生成素(thymicstromallymphopoietin,TSLP)和嗜酸性细胞阳离子蛋白(eosinophilcationicprotein,ECP)表达水平存在差异,可为临床发现AC的患病机制及疾病诊断的研究提供思路与方法｡王朱健等[40]发现,泪液单纯疱疹病毒特异性IgA(herpessimplexvirusspecificimmunoglobulinA,HSV-IgA)的敏感度和特异度极高,患病眼的HSV-IgA要明显高于未患病眼及对照组水平,说明泪液HSV-IgA检测有潜力成为单纯疱疹病毒性角膜炎(herpessimplexkeratitis,HSK)诊断指标｡谢小东等[41]在一项临床试验中发现泪液中分泌型免疫球蛋白A(secretoryimmunoglobulinA,sIgA)可作为基质型单纯疱疹病毒性角膜炎的高危标记物｡

3.2泪液检测与眼病中医证型的关系

3.2.1肝经郁热型干眼具体证候表现为目珠干涩,灼热刺痛,或白睛微红,或黑睛星翳,或不耐久视;口苦咽干,烦躁易怒,或失眠多梦,大便干或小便黄;舌红,苔薄黄或黄,脉弦数[42]｡刘培等[43]通过泪液蛋白质组学对肝经郁热型干眼患者与健康人群泪液进行检测,筛选出差异蛋白,并对差异蛋白进行生物信息学分析,发现2组泪液之间存在生物学差异,磷酸二酯酶1(ectonucleotidepyrophosphatase1,ENPP1)有望成为肝经郁热型干眼的泪液生物标志物｡

3.2.2肝郁阴虚型干眼具体证候表现为目珠干燥无泽,涩磨畏光,灼热刺痛,口苦口干,烦躁易怒,舌淡红,苔薄或薄黄,脉弦细｡吴改萍[44]采用4D-Label-free蛋白质定量技术检测逍生散颗粒剂联合0.3%玻璃酸钠滴眼液治疗前､后干眼患者泪液蛋白质,通过这些蛋白发现二者联合用药具有抗细胞凋亡､激发机体免疫应答､调节甲状腺激素分泌､改善细胞代谢､维持细胞稳态的作用｡

3.2.3肝肾阴虚型干眼肝开窍于目,主泪液,若肝失调和,致使泪液分泌不足;肾主藏精､水,可有效调节体内水液的代谢和分布｡而肝肾同源,二者病变会互为影响,进而演变为干眼｡张海等[45]通过文献分析发现,肝肾阴虚证为干眼最主要证型｡彭银艳等[46]通过临床试验发现,杞菊地黄汤联合玻璃酸钠滴眼液能有效降低肝肾阴虚患者泪液中MMP-2､MMP-9水平｡MMP-2､MMP-9在机体处于应激状态时,可由眼表细胞大量分泌,进而损伤角膜角质层细胞[47-48]｡该试验证明了中西医结合疗法能有效减轻角膜上皮细胞的损伤,从而改善眼表功能,且安全可靠｡

4、小结

泪液采集和泪液检测具有无创､便利､非侵入性的优点,已应用于部分眼表疾病和具有眼部并发症的全身系统性疾病的诊断,有望成为普遍性诊疗手段｡泪液采集与检测当前存在的问题是泪液分泌量较少,这导致样本量小､难以规范样本量大小,且缺乏泪液采集与保存方式的权威“金标准”;同时,现在缺乏统一的､为眼科学界所认可的泪液分子生物标志物数据库,这将带来一些由于不同泪液采集方法以及不同泪液检测方法而导致的误差;此外,不同泪液检测方式产生的检测结果之间难以有一个统一的衡量与诊断标准｡因此,研制出能消耗更少泪液样本量､且更安全无创､易于临床操作的泪液采集方式及检测方式是未来研究的重点,编写泪液采集及检测指南､建立泪液生物标志物数据库也是一项当前亟待发展的方向｡

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基金资助:湖南省自然科学基金创新研究群体项目(2024JJ1007);

文章来源:伏书玥,梁昊,彭清华.泪液检测在眼科疾病诊断应用中的研究进展[J].中国中医眼科杂志,2025,35(05):482-486.