糖尿病视网膜病变(diabeticretinopathy,DR)已成为当今世界范围内糖尿病患者常见的微血管并发症。该疾病由多重病因所致,但其具体发生机制仍未完全清楚[1]。高糖环境会在体内引发炎症和刺激新生血管生成,继而导致DR。内脏脂肪素(Visfatin)是一种新型脂肪因子,具有类胰岛素、烟酰胺磷酸核糖转移酶活性及引起炎症反应等生物学效应[2,3,4]。临床研究表明2型糖尿病视网膜病变患者中Visfatin的表达明显增加[5,6]。而且研究显示早期糖尿病大鼠视网膜全层高表达Visfatin,认为部分原因可能由Müller细胞分泌产生该因子,进而促进血管内皮生长因子(VEGF)的表达上调[7],从而促进DR发生。重楼皂苷I(PolyphyllinI)是重楼提取物的一种,百合科植物根茎,是常用的一种治疗玻璃体视网膜疾病的中药成分。国内外的药理学及医学研究表明,PolyphyllinI具有抗肿瘤的功效,且其对非肿瘤细胞无药物毒性作用。PolyphyllinI可以通过调节Bcl-2蛋白的途径诱导肿瘤细胞的凋亡且能显著抑制BGC823、SMMC-7721、SGC-7901等肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡[8]。同时,视网膜色素上皮细胞作为增殖性糖尿病视网膜病变重要的参与细胞,可能与Visfatin有一定联系。因此,我们通过建立高糖环境的视网膜色素上皮细胞模型,观察Visfatin在视网膜色素上皮细胞中的表达情况,以及PolyphyllinI对Visfatin过表达的影响,了解Visfatin是否通过色素上皮细胞参与DR的发生,为疾病治疗提供有益靶点,并探索治疗新方向。

1、材料和方法

1.1材料

人视网膜色素上皮细胞ARPE-19(上海中乔新舟生物公司);一抗:兔抗Visfatin多克隆一抗抗体(Abcam,USA),兔抗VEGF多克隆一抗抗体及GAPDH(武汉博士德生物公司);二抗:羊抗兔二抗IgG(H+L),荧光标记羊抗兔荧光二抗CY3及FITC;DMEM/F12培养基(美国Gibco公司);特级南美ABW胎牛血清(武汉博士德生物公司);Westernblot裂解液试剂盒(深圳碧云天生物技术有限公司);逆转录试剂盒、PCR试剂盒(Fermentas,USA);重楼皂苷I(上海麦克林生化科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1人视网膜色素上皮细胞的培养

传代培养人视网膜色素上皮细胞系,培养液配制:1%双抗、10%胎牛血清、DMEM/F12培养基。依照培养情况分组:正常对照组、高糖组、高糖加PolyphyllinI药物干预组。具体方案参照文献[4,7],正常对照组:在含5.5mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培养基中培养;高糖组:细胞培养溶液中添加25mmol/L高浓度葡萄糖;药物干预组:将25mmol/L高浓度葡萄糖和3μg/L的PolyphyllinI药物加入到细胞培养基中。置入温度为37℃的湿热细胞培养箱中,将条件设置为5%CO2,95%空气各组细胞均同条件下处理12h。

1.2.2免疫荧光染色法

正常对照组、高糖组和药物干预组均用96孔板接种4×104cell/L,每孔100μL,2个复孔/组,培养箱环境为湿度100%,温度37℃,5%CO2,待细胞生长至70%时,用PBS洗涤3min/次,共3次;室温下4%多聚甲醛固定15min,每次用PBS洗3min;每孔中加入0.5%TritonX-100通透20min,PBS清洗3次,每次3min;在37℃下15%胎牛血清液50μL封闭1h;弃去封闭血清,按照分组每孔分别滴加对应一抗(1∶100),避光孵育4℃过夜,PBS液3min/次清洗(3次),等体积PBS液做阴性对照;各组每孔滴加荧光标记二抗CY3或FITC(1∶100),避光置于37℃恒温箱反应1h;再次使用PBS清洗3次,每次3min;荧光淬灭封片剂封片。荧光显微镜暗室观察Visfatin和VEGF在细胞中的表达和分布。

1.2.3实时荧光定量PCR法

检测各组细胞中Visfatin和VEGFmRNA的表达:提取各组色素上皮细胞总RNA(Trizol法);冰浴解冻模板RNA及配置溶液,将5×gDNABuffer(2μL)、总RNA、RNase-FreeddH2O(补足至10μL)配制混合液,短离心后置于42℃孵育,用10×KingRTBuffer(2μL)、FastKingRTEnzymeMix(1μL)、FQ-RTPrimerMix(2μL)及RNase-FreeddH2O(补足至10μL)配制反转录混合液,gDNA反应液中加入反转录反应中的Mix,混匀后42℃孵育15min;92℃孵育3min后得到cDNA后进行PCR反应,使用PrimerExpress5.0软件编辑引物序列如下,产品为PAGE纯化。Visfatin引物(109bp):上游5'-CCAGCGGCAGAGCACAC-TACC-3',下游:5'-CGCTGACCACAGACACAG-GCA-3',VEGF引物(195bp):上游5'-TCCCAGCCTGGCCAAC-CCTT-3',下游5'-ATGGGTCACCCCAGGGCTCC-3',反应参数为Visfatin:94℃5min预变性,93℃30s扩增,55℃45s,72℃45s,30个循环,最终延伸72℃7min;VEGF:94℃5min预变性,94℃30s扩增,55℃45s,72℃60s,30个循环,最终延伸72℃7min。每组15个复孔并以GAPDH引物为内参。扩增完成后,用PCR自动分析软件和比较RT法检测各组mRNA的表达情况。

图1人视网膜色素上皮细胞中Visfatin和VEGF的荧光表达(×400)

1.2.4Western-blot法

5×104/L于6孔板培养正常对照组、高糖组和药物干预组,贴壁生长至70%时,在冰上进行操作,用预冷的PBS液漂洗2～3次后,增强型细胞裂解液200μL/孔(1mL裂解液与10μL蛋白酶抑制剂混合),在冰浴中裂解30min使细胞完全裂解,离心10min(10000r/min,4℃),收集上清加入5×SDS-PAGE上样液,将混合液EP管置于95℃水浴,蛋白变性10min;取20μL混合液上样于聚丙烯酰胺凝胶孔中,70V电压电泳至溴酚蓝染料达浓缩胶处,调节电压至110V,溴酚蓝到凝胶底端时停止电泳;恒流150mA电转转膜50min至0.2μmPVDF膜上。用TBST制备5%脱脂奶粉室温封闭孵育2h,根据目的蛋白分子量切膜,切好的条带放置于对应一抗内,4℃孵育过夜;TBST洗膜5min(3次);二抗中4℃摇动孵育2h;ECL发光显色试剂显影,将GAPDH用作内部对照,以比较各组中蛋白的相对表达。

统计学分析:采用SPSS23.0软件进行分析,计量资料用均数±标准差表示,多组间比较采用完全随机设计的单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1各组免疫荧光检测结果

实验结果显示:Visfatin蛋白在正常人视网膜色素上皮细胞的胞质中弱阳性表达,呈弱红色荧光(图1A)。VEGF蛋白在正常人视网膜色素上皮细胞中呈弱绿色荧光(图1D)。高糖组模型中,Visfatin和VEGF在视网膜色素上皮细胞中均可见到强阳性表达,Visfatin呈红色强荧光,VEGF呈绿色强荧光,二者在细胞质与细胞核中均呈强荧光染色(图1B、E)。给予PolyphyllinI干预高糖状态后,Visfatin和VEGF均表达较高糖组减弱,且细胞形态不规则或发生皱缩(图1C、F)。

2.2各组细胞中Visfatin和VEGFmRNA的相对表达量

RT-PCR检测,3组视网膜色素上皮细胞中VisfatinmRNA和VEGFmRNA相对表达量比较,差异具有统计学意义(F=7.78、8.44,均P<0.01)。高糖组VisfatinmRNA水平较正常对照组明显增高(t=4.24,P<0.01);高糖加PolyphyllinI药物干预组VisfatinmRNA水平较高糖组表达降低(t=3.89,P=0.02);而药物干预组与正常对照组间无显著差异(t=0.37,P=0.23)。高糖组中VEGFmRNA表达水平较正常对照组明显升高(t=3.53,P<0.01),且其mRNA水平高于干预组(t=2.57,P=0.01),而干预组与正常对照组比较,差异无统计学意义(t=0.58,P=0.12),见表1,图2。

2.3各组细胞中Visfatin和VEGF蛋白表达量

Western-blot结果显示,各组人视网膜色素上皮细胞中Visfatin蛋白和VEGF蛋白相对表达量比较,差异均有统计学意义(F=13.14、8.59,均P<0.01)。Visfatin蛋白水平,高葡萄糖组表达量显著高于正常对照组(t=3.62,P=0.01),干预组表达低于高糖组(t=3.79,P<0.01),差异有统计学意义,VEGF蛋白水平,高葡萄糖组表达量显著高于正常对照组(t=3.09,P<0.01),干预组表达低于高糖组(t=2.87,P<0.01),差异有统计学意义,见图3,表2。

3、讨论

近年来,Visfatin与糖尿病相关的研究引起了广泛关注。研究发现2型糖尿病及其血管病变的机体中,Visfatin表达量显著升高,可引发一系列病理生理改变[9,10]。DR作为糖尿病微血管并发症的一种,Visfatin可能同样参与其中[11]。研究表明DR中纤维血管增殖膜形成与Visfatin的表达增多有一定关系[12]。另有报道指出:DR中视网膜新生血管,可能通过Visfatin的促炎症反应特性诱导氧化应激,或类胰岛素效应增强蛋白激酶C(proteinkinaseC,PKC)活性形成[13]。然而DR的发生发展还由其他多种因素共同参与,本研究观察了Visfatin在模拟高糖环境下,人视网膜色素上皮细胞中的表达情况及其与VEGF的关系,并应用PolyphyllinI作为干预抑制剂进行DR治疗的初步探讨,以期发现与病因相关的关键作用靶点,为DR防治提供新策略。在DR的视网膜细胞研究中,视网膜血管内皮细胞的相关研究较多,色素上皮细胞的研究甚少。视网膜色素上皮细胞有调节眼内电解质平衡、构成血-视网膜屏障及分泌多种生长因子等保护及再生作用[14]。本研究中发现,在人视网膜色素上皮细胞中的Visfatin表达升高,推测高糖环境下色素上皮细胞可以分泌Visfatin,并可能与DR的发生机制相关。研究表明,高糖、低氧、机械损伤、糖基化等影响下,Visfatin可激活胶质细胞,诱导Müller细胞分泌VEGF使得表达上调[7],推测色素上皮细胞中可能存在相似的作用方式。而Visfatin和VEGF的表达升高可能促进色素上皮层新生血管形成[15]。色素上皮细胞的细胞骨架中相关的转化生长因子-β1(transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)可直接调控VEGF的表达[16]。且细胞中不仅可以分泌促进新生血管形成的VEGF,还可以分泌出抑制血管生成的因子[如重组人色素上皮衍生因子(pigmentepithelium-derivedfactor,PEDF)等],二者间的动态平衡及其形成的物理屏障,可以有效地抑制脉络膜新生血管的形成[17]。我们认为糖尿病患者眼底视网膜细胞长期处于缺氧状态,致色素上皮层基底部VEGF异常分泌,一系列靶基因表达上调,Bruch膜受损使视网膜对疾病的抵御能力下降,影响各分子通路的激活,如PI3K/Akt和ERK(1/2)通路作用,使得细胞增殖新生血管形成,影响脉络膜的供养能力,造成眼底光感受器细胞因缺营养而死亡[18,19],破坏了色素上皮层的屏障功能。因此,Visfatin在色素上皮细胞中的表达升高提示其可能主要作用于DR视网膜的缺血阶段,可能是局部缺血引起色素上皮细胞中Visfatin的表达增加,进而激活VEGF的表达,最终引起视网膜新生血管形成。我们将视网膜色素上皮细胞视为重点研究对象,希望能够以此为突破口,进一步研究DR的发生机制、早期诊断与治疗。

图2三组视网膜色素上皮细胞中VEGFmRNA和VisfatinmRNA相对表达量比较

图3Western-blot法检测各组细胞中Visfatin与VEGF蛋白表达情况

表1各组细胞中VisfatinmRNA和VEGFmRNA相对表达量的比较

表2各组细胞中Visfatin和VEGF蛋白相对表达量的比较

Visfatin可能通过多种途径作用于DR的发生发展中,使内皮细胞增殖和迁移、色素上皮细胞活化等反应,促进血管平滑肌成熟和参与新生血管形成[20]。Adya等、Kim等、Bea等提出Visfatin通过PI3K及NF-кB信号通路、介导mTOR通路或激活ERK(1/2)通路形成新生血管[21,22]。因此我们认为,Visfatin可能通过上述某些通路诱导形成病理性新生血管[23]。本研究中高糖缺氧的状态下视网膜色素上皮细胞中的Visfatin过表达,说明Visfatin对于DR的发生发展起着不可忽略的作用。此外,本次实验还观察到高糖环境中Visfatin与VEGF同时呈现高表达状态,药物干预后二者表达均有所减弱,推测视网膜新生血管的生成方面,Visfatin和VEGF存在类似作用效果,或Visfatin可以调控VEGF的表达。研究发现Visfatin能够发挥抗凋亡效果,抑制血管内皮细胞增殖,经PI3K/Akt和ERK(1/2)通路促VEGF表达及新生血管形成[24,25]。Visfatin可以诱导Akt磷酸化,或激活某些炎性因子,使VEGF表达增多[26,27]。我们由此推测Visfatin可能对VEGF起正性调控作用。因此视网膜色素上皮细胞中Visfatin,在DR的视网膜增殖阶段发挥重要效果,促使血管生成因子活跃,新生血管形成。

PolyphyllinI是重楼提取物中的一种,是治疗玻璃体视网膜病变的一种药物[8]。我们在实验中发现视网膜色素上皮细胞在高糖环境中增殖,且Visfatin及VEGF表达量增加,在给予PolyphyllinI药物干预后,色素上皮细胞的增生受到了一定程度的抑制,Visfatin和VEGFmRNA和蛋白水平明显下降,证明PolyphyllinI可能作为视网膜新生血管生成的抑制剂存在,对相关眼病起治疗作用。这与苏菲菲等研究有相似之处,即PolyphyllinI抑制色素上皮细胞增殖、快速诱导细胞凋亡,也可下调VEGF的表达,抑制新生血管形成,与Bcl-2、CyclinD1、Bax、ERK(1/2)、p-ERK(1/2)和cleavedcaspase-3等因子相关[4,28,29]。也有研究报道,重楼可抑制肿瘤细胞增殖、促进其凋亡的作用,作用机制可能与Bcl-2表达下调相关[30]。PolyphyllinI同样具有抗肿瘤作用,是广泛应用于各类肿瘤疾病的中药,其肿瘤抑制作用可能多数通过PI3K/Akt/mTOR介导[29,30,31],与介导DR的通路相同。我们认为该药物可能对DR起到治疗的效果,同时PolyphyllinI兼具对非肿瘤细胞无细胞毒性的特性,较同类临床药物风险更低,治疗收益更高。由此推测,PolyphyllinI有望成为治疗DR乃至DM的潜力药物。

采用体外细胞高糖模型模拟DR环境,可能与人类DR的生理环境不完全相同。但在本研究中,高糖刺激后机体视网膜色素上皮细胞内出现Visfatin和VEGF表达增加,而PolyphyllinI的干预可抑制因子表达。因此,Visfatin做为新靶点可为DR的防治提供新的方向,但相关通路信息还有待更加深入的探索。PolyphyllinI可能成为治疗DR的潜力药物,但仍需进一步研究拓展。

参考文献：

[3]杨媚,杨刚毅,李伶,等.不同糖耐量个体血浆内脂素水平的变化.中华内分泌代谢杂志2006;22(3):245-247.

[4]苏菲菲,卢木娣,曾惠红,等.重楼皂苷Ⅰ对人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19增殖的影响.眼科新进展2016;36(6):528-531.

[5]刘真真,刘金波,刘传谦,等.2型糖尿病微血管病变患者血浆内脂素水平变化及意义.山东医药2018;58(14):47-49.

[6]赵高宇,马金兰,张瑞霞.VEGF-B与低氧诱导大鼠视网膜新生血管的相关性.中国高原医学与生物学杂志2018;39(1):34-38.

[7]路强,杨晓静,崔巍,等.实验性糖尿病大鼠视网膜中VisfatinmRNA及蛋白表达研究.内蒙古医学院学报2012;34(1):11-15.

[8]宣群,潘红梅.滇重楼内生真菌转化万古霉素的研究.昆明医科大学学报2014;35(11):10-12.

[11]路强,杨晓静,崔巍,等.内脏脂肪素和血管内皮生长因子在早期糖尿病大鼠视网膜中的表达及意义.中华实验眼科杂志2013;31(1):45-48

[12]杨晓静,崔巍,高伟,等.人增殖性糖尿病视网膜病变纤维血管膜中Visfatin的表达研究.内蒙古医学院学报2012;34(4):285-288

[15]徐建锋,杨丽君,莫荔,等.真实世界下玻璃体腔内注射抗VEGF药物治疗眼底疾病的实效性研究.国际眼科杂志2017;17(9):1734-1737.

[27]梁宁林.原发性肝癌患者血清内脂素､血管内皮生长因子表达及意义.临床消化病杂志2017;29(1):33-36.

[28]龙剑文,皮先明,涂亚庭.重楼皂苷Ⅰ对IL-17刺激HaCaT细胞分泌VEGF和IL-23的影响.中国皮肤性病学杂志2016;30(5):453-455,498.

[31]王娓娓,吴雪松,张红苗,等.重楼皂苷I对体外抑制冠状动脉内皮细胞增殖的影响.昆明医科大学学报2016;37(11):37-40.

邵义男,路强,杨晓静.高糖环境下内脏脂肪素在人视网膜色素上皮细胞中的作用[J].国际眼科杂志,2020,20(12):2028-2033.