2型糖尿病(type2diabetesmellitus,T2DM)是以糖代谢紊乱为特点的内分泌代谢性疾病,糖尿病视网膜病变(diabeticretinopathy,DR)系其常见、严重全身微血管并发症之一,是导致患者视功能受损的重要原因[1]。调查显示,T2DM患者DR患病率超过30%,且有明显逐渐上升趋势[2]。当前尚未完全明确DR发病机制,早期多认为与高糖应激损伤、糖基化终末产物及血管内皮细胞功能受损等机制有关[3,4]。T2DM长期血糖控制不佳,可引起视网膜局部血管血流动力学改变,造成视网膜缺血、缺氧,导致多种炎症细胞因子及促血管内皮生长因子释放,诱导视网膜新生血管形成[5]。近年来越来越多证据显示,微小RNA(miRNA,miR)参与细胞增殖、分化及凋亡等过程,与血管病变密切相关,影响血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)信号通路转导过程[6,7]。miR-27首次在宫颈癌细胞株内发现,已证实在心血管病变中有关键作用,直接参与氧化应激、炎症反应等过程,同时对机体脂代谢产生影响[8]。近期有报道发现,T2DM高糖环境可诱导miR-27表达,参与内质网应激、组织纤维化等血管病变过程[9]。但对miR-27在DR发病过程中的作用尚未明确。本研究现对收治的DR患者80例血浆miR-27、血清VEGF进行检测,并与单纯T2DM、正常健康人对照,以明确miR-27在DR发病及进展中的作用,以期为DR防治提供依据。

1、对象和方法

1.1对象

前瞻性研究。收集我院2019-01/2020-01收治的DR患者80例。纳入标准:DR诊断与分期满足中华医学会眼科学会眼底病学组通过的DR临床诊疗指南(2014年)标准[10],分期Ⅰ～Ⅵ期,经眼底荧光素血管造影证实;原发性T2DM,病程2a及以上;眼压正常;屈光介质基本正常;未接受抗DR治疗;临床资料完善。排除标准:合并严重心脑血管病变、肝肾功能衰竭、全身恶性肿瘤;近期有手术及创伤史;合并白内障、青光眼、视网膜静脉阻塞、视神经疾病等其他眼部疾患;糖尿病其他并发症;因各类原因无法配合眼科检查者;急慢性感染;长期糖皮质激素应用史或抗精神疾病类药物应用史者;合并库欣综合征、甲状腺功能亢进等其他影响糖代谢疾病者;自身免疫系统疾病;孕期或哺乳期女性;临床资料不全。选择同期收治未合并DR的单纯T2DM患者40例作为T2DM组,均满足中国T2DM防治指南中T2DM诊断标准[11]。同期来医院体检的正常健康人40例作为对照组,无T2DM病史,空腹血糖<6.1mmol/L,餐后2h血糖<7.8mmol/L,经体格检查体健,无心肝肾肺疾病、无风湿免疫系统疾病。本研究通过我院医院伦理委员会审查,所有受试者均知情同意。

1.2方法

1.2.1临床资料收集

均由专人通过调取医院信息系统内所保存患者病例资料采集受试者性别、年龄、既往史、病程、血糖等资料。录入Excel系统后,由2～3人复核,确定无遗漏、满足入组标准后进入研究,进行统计学分析。

1.2.2miR-27检测

所有受试对象就诊当日均留取空腹肘静脉血标本5mL,参照Trizol总RNA抽提试剂盒(美国ThermoFisher公司)提取RNA,参照GIAGEN试剂盒纯化,RNA纯度及浓度满意后,电泳检测RNA完整性。反转录实时荧光定量聚合酶连反应(realtimefluorescentquantitativereversetranscriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR)法测定血浆miR-27表达,miR-27逆转录采用茎环法反转录,总RNA反转录呈扩增模板cDNA,反转录特异性引物序列:miR-27上游引物序列:5'-CGGCGGTTTCACAGTGGCTAAG-3',下游引物序列:5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3';内参U6上游引物序列:5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3',下游引物序列:5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'(引物设计及合成均由上海生工生物工程股份有限公司完成),采用日本TaKaRa公司SYBR®PremixExTaqTMⅡ试剂盒进行RT-PCR反应,反应体系:5μL2×MasterMix+PCR特异性上下游引物各0.5μL+双蒸水补足至8μL。反应条件:95℃预变性30s,95℃变性5s,60℃退火20s,60℃延伸20s,40个循环,于61℃采集荧光信号,美国Bio-Rad公司FX-96型PCR仪检测miR-27相对表达量,以U6为内参,参照2-△△ct公式[12,12]计算miR-27相对表达量,每样本均设3复孔,重复测定3次取均值。

1.2.3VEGF检测

受试当日均采集外周空腹静脉血3mL,5000r/min离心5min,分离血清,采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验法测定血清VEGF水平,试剂盒购自美国R&D公司,严格按试剂使用说明操作。

统计学分析:SPSS24.0统计学软件包对研究数据进行统计分析,年龄、病程、miR-27、VEGF表达等计量数据均进行正态性与方差齐性检验满足要求,采用均数±标准差(x¯±s)描述,组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,多个样本之间两两比较采用SNK-q法;性别、DR分期等计数数据采用构成比(%)描述,组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法分析,DR患者血浆miR-27表达影响因素采用多因素Logistic回归分析,血浆miR-27与血清VEGF及血糖相关指标相关性分析采用Pearson相关分析法,P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1三组研究对象临床资料比较

DR组包括非增生型糖尿病视网膜病变(non-proliferativediabeticretinopathy,NPDR)54例,包括Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期各12例、24例、18例;增生型糖尿病视网膜病变(proliferativediabeticretinopathy,PDR)26例,包括Ⅳ期、Ⅴ期、Ⅵ期各10例、11例、5例。三组性别构成、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05),糖尿病病程、空腹血糖、糖化血红蛋白差异有统计学意义(P<0.001),见表1。

表1三组研究对象临床资料比较

表2三组研究对象血浆miR-27相对表达量及血清VEGF水平比较

表3不同DR分期患者血浆miR-27相对表达量、血清VEGF水平及血糖指标比较

表4DR患者血浆miR-27相对表达量影响因素分析

2.2三组研究对象血浆miR-27相对表达量及血清VEGF水平比较

三组研究对象血浆miR-27、血清VEGF比较差异均有统计学意义(P<0.001),DR组、T2DM组血浆miR-27、血清VEGF高于对照组,差异有统计学意义(q=23.749、9.235;20.661、4.682,P<0.05),DR组又高于T2DM组,差异有统计学意义(q=13.085、15.254,P<0.05),见表2。

2.3不同DR分期患者血miR-27相对表达量、VEGF水平及血糖指标比较

PDR患者血浆miR-27、血清VEGF、空腹血糖及糖化血红蛋白水平均高于NPDR患者,差异有统计学意义(P<0.05),见表3。

2.4DR患者血浆miR-27相对表达量影响因素分析

纳入单因素分析中有统计学意义变量进入多因素Logistic回归分析(α入=0.05,α剔除=0.10),结果显示:病程、空腹血糖、糖化血红蛋白、血清VEGF、DR分期均为DR患者血浆miR-27相对表达量的影响因素(P<0.05),见表4。

表5DR患者血浆miR-27相对表达量与血清VEGF、空腹血糖、糖化血红蛋白的相关性分析

2.5DR患者血浆miR-27相对表达量与血清VEGF、空腹血糖、糖化血红蛋白的相关性分析

相关性分析结果显示:DR患者血浆miR-27相对表达量与血清VEGF、空腹血糖、糖化血红蛋白均呈正相关(P<0.05),见表5,图1。

3、讨论

DR为糖尿病最为严重微血管并发症之一[13]。已明确DR是导致视功能受损及失明的重要原因[14]。但目前尚未完全阐明其发病机制,明确DR病因及病情进展影响因素对DR防治有积极意义。近年来越来越多报道指出,DR为多基因参与阶段性疾病,涉及多元醇通路激活、蛋白激酶C激活,与蛋白质非酶糖基化反应、免疫炎症反应、VEGF基因及miRNA基因调控等密切相关[15,16]。其中miRNA在DR发病中的作用已成为临床研究者关注的特点。已明确miRNA参与T2DM、心血管病变、炎症反应及恶性肿瘤形成等过程[17,18]。miRNA属高度保守单链小分子RNA,调控超过50%的蛋白质转录及翻译[19]。miR-27为首次在宫颈癌细胞株分离获得的小分子RNA类型,位于17号染色体,已证实存在癌基因作用,参与乳腺癌、胰腺癌等多种实体瘤发病、增殖及迁移过程[20,21]。最新研究显示,miR-27存在促血管生成作用,可通过抑制靶基因转录,促进VEGF受体2信号转导,导致血管新生[22]。而敲除miR-27表达可抑制模型小鼠血管再生[23]。以上观点认为miR-27调控血管新生,参与血管发育及损伤修复过程。miR-27参与T2DM病程进展已有已有报道,研究认为miR-27表达影响T2DM治疗及预后[24]。但对其在DR发病中的作用鲜少见报道。当前用于miRNA检测方法包括RT-PCR、分子探针技术、直接测序法及miRNA芯片微阵列技术等,其中RT-PCR法因具备更高的灵敏度及特异性广泛应用于miRNA定量测定[25]。本研究中,所有受试者均采血,应用RT-PCR法测定血浆miR-27相对表达量,结果显示,DR组、T2DM组血浆miR-27相对表达量均高于正常对照组,支撑Wang等[26]研究观点,提示miR-27在T2DM及T2DM微血管并发症发病中均有重要作用。考虑miR-27主要分布于富含血管及细胞组织内,与血管功能及稳态密切相关,在血管内皮细胞内含量较高,主要通过调控血管内皮细胞功能,影响血管稳态及功能,参与血管损伤修复、新生及老化等病理、生理过程,同时可通过与靶基因结合参与血管炎症反应过程[27];而DR主要以糖尿病微血管病变及视网膜新生血管为特点,miR-27过表达可促进DR新生血管形成,诱导血管生长因子表达,促进细胞分化、增殖,加重血管炎症反应,介导DR微血管损伤。

图1DR患者血浆miR-27相对表达量与血清VEGF、空腹血糖、糖化血红蛋白的相关性散点图

有研究发现VEGF参与DR发病及进展过程,与DR病情严重程度有关,PDR患者血清VEGF水平较NPDR高2～3倍左右[28,29]。本研究发现,DR及T2DM患者血清VEGF表达均较正常人高,同时DR中PDR患者血清VEGF表达水平明显高于NPDR,与上述结论一致,提示VEGF与DR发病及进展紧密相关。同时本研究还发现,DR、T2DM及正常人群中血清VEGF与血浆miR-27表达趋势接近,两者均与DR空腹血糖、糖化血红蛋白变化有关。推测miR-27可能通过调控VEGF表达,参与T2DM微血管病变过程,同时血糖水平可能直接影响miR-27表达。糖化血红蛋白系仅2～3mo内血糖控制水平的反馈,前期已明确,血糖控制不佳直接加速DR病情进展[30]。糖化血红蛋白作为晚期糖基化产物之一,其浓度上升、大量沉积直接激活糖基化中膜产物受体表达,导致氧自由基释放增多,造成组织缺氧,造成血管通透性提升,介导新生血管生成,加速DR病变及进展[31]。而VEGF作为促血管生成的关键因子,直接参与血管通透性调节及新生血管生成过程,与T2DM微血管病变及DR病程进展有关[32]。而本研究发现,以上各因子均影响miR-27表达,考虑miR-27可能通过糖代谢途径,影响VEGF合成及表达,参与DR发病及病情进展过程;T2DM患者长期血糖控制不佳,诱导糖基化终产物释放及沉积,加重氧化应激损伤,而miR-27参与糖异生、胰岛素信号转导等调节过程,导致机体糖耐量降低,肝糖异生加强,血葡萄糖浓度上升,导致大量内皮细胞微粒释放,进一步加重血糖代谢紊乱所致糖尿病微血管病变,造成血管内皮功能受损,导致DR发病及视网膜血管病变进展。此外,本研究还发现,病程、DR分期均为DR患者miR-27表达影响因素,即病程越长、DR增生性病变越严重患者miR-27相对表达量更高,考虑随T2DM患者病程进展,微血管糖基化损伤越严重,miR-27表达量增加,可进一步诱导VEGF释放,促进血管生成,增加血管内膜通透性,加剧血管壁炎症反应,导致DR病情进展。另外,本研究相关性分析证实,miR-27相对表达量与DR患者血清VEGF、空腹血糖及糖化血红蛋白均呈正相关,进一步证实miR-27可能糖代谢、促VEGF释放等途径参与DR发病及病情进展过程,或可能为DR防治的新靶点。

综上所述,本研究发现,DR患者血浆miR-27相对表达量较单纯T2DM及正常健康人高,且与DR病情进展有关;T2DM病程、血清VEGF、空腹血糖、糖化血红蛋白、DR分期均影响DR患者miR-27表达,且DR患者miR-27相抵表达量与同VEGF、空腹血糖、糖化血红蛋白呈正相关,推测miR-27可能通过调控糖代谢、促血管生成等途径参与DR发病及进展过程,有望作为DR防治研究的新方向。但对其参与DR发病的确切机制及信号途径本研究尚未完全明确,有待开展动物试验或体外研究证实。

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