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基于网络药理学探讨祛痹痛风饮治疗痛风的作用机制

2021-09-29 62 上传者：管理员

摘要：目的运用网络药理学方法探讨祛痹痛风饮治疗痛风的活性成分、作用靶点及其潜在的治疗作用机制。方法基于中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)获取祛痹痛风饮的活性成分和作用靶点,结合Uniprot数据库对靶点进行标准化处理。采用Cytoscape3.7.2软件绘制出祛痹痛风饮的活性成分–痛风靶点网络。通过GeneCards、OMIM、TTD、DRUGBANK数据库获得痛风的疾病靶点。将药物的作用靶点与疾病靶点进行交集,获得共同靶点。将交集靶点应用STRING数据库构建蛋白–蛋白相互作用网络图(PPI),通过DAVID数据库对共同靶点进行基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析,并将结果进行可视化处理。结果共预测到祛痹痛风饮中191个活性成分,87个与痛风共同的靶点。GO功能富集分析显示与炎症反应、细胞对脂多糖的应答、基因表达的正调控等相关。KEGG通路富集分析结果显示主要涉及Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路、NF-κB信号通路等方面。结论祛痹痛风饮可能通过促进尿酸排泄、抑制炎症因子的释放减轻、炎症反应发挥治疗痛风的作用,为深入研究祛痹痛风饮治疗痛风的作用机制提供了理论参考。

关键词：
Toll样受体信号通路
痛风
祛痹痛风饮
网络药理学
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痛风是指与高尿酸血症、尿酸盐沉积密切相关的进展性代谢疾病，由于血尿酸水平升高导致尿酸盐结晶沉积在组织、关节以及肾脏等部位，严重者可造成关节破坏、肾功能受损。尿酸与冠心病、糖尿病、帕金森病、银屑病、阿尔茨海默病等多系统疾病密切相关。随着我国经济水平的进一步提高及膳食结构的多样化，痛风发病率逐年增加。据报道，美国有超过200万人患有痛风；在中国，痛风和高尿酸血症患病率分别为1.1%、13.3%，而且呈现明显上升和年轻化趋势。现代医学治疗高尿酸血症和痛风的途径主要包括抑制尿酸合成和增加尿酸排泄，但是目前的抗痛风药物包括别嘌醇、非布司他、丙磺舒、苯溴马隆等都具有一定的不良反应，如皮疹、肝毒性和诱发尿结石等，而且治疗靶点单一，停药后痛风易复发。近年来中药在治疗痛风方面的优势逐渐凸显，关于其治疗痛风的经验日渐增多，但其治疗的内在机制尚需进一步分析验证。

痛风属于中医“痹证”“白虎历节”等范畴。痛风病名首见于《格致余论》：“彼痛风者，大率因血受热已自沸腾，其后或涉冷水，或立湿地，或扇取凉，或卧当风，寒凉外搏，热血得寒，汗浊凝涩，所以作痛；夜则痛甚，行于阴也”。崔公让教授总结多年临床经验，据《金匮要略》：“诸肢节疼痛身体魁羸，脚肿如脱，头眩短气”提出“魁羸论”，认为痛风患者体质为本虚标实，将痛风的病因病机归纳为以脾肾阳虚为本，湿热血瘀为标。在痛风的临床治疗中，崔公让教授以祛痹痛风饮为基础方进行辨证加减，其组方精良，由柴胡、黄芩、葛根、山慈菇、两头尖、薏苡仁、木贼、大黄、甘草9味中药组成。该方以柴胡、黄芩、葛根为君药，清热解毒、疏肝通络、活血通经；山慈菇、大黄为臣药，助君药以清热化瘀，借大黄利湿泄浊，使湿热浊邪从二便而出，尿酸排泄有道；木贼、两头尖为佐药，既可温阳祛湿，又可防黄芩、山慈菇、大黄寒凉伤脾胃；甘草调和诸药。诸药合用，共奏清泄湿热、化瘀通络之效。痛风急性期治以清热消肿止痛，慢性期则健脾温肾，培补气血生化之源，临床中以祛痹痛风饮随证加减效如桴鼓。本课题组前期研究证明此方可以显著降低患者尿酸盐结晶，促进尿液中尿酸排出，但其具体作用机制尚未完全阐明，仍然需要进一步探索来扩大其应用。

网络药理学是一门融合了蛋白组学、基因组学、系统生物学等多学科理论的新兴学科，综合运用生物学及计算机技术，从整体分析中药的成分、靶点，揭示其药效物质基础、作用的分子机制，与中医整体观及辨证论治原则相契合。因此本研究拟通过网络药理学对祛痹痛风饮治疗痛风的成分和靶点进行挖掘，探析其药理作用机制，为后续临床相关基础应用研究提供思路。

1、材料与方法

1.1活性成分及其作用靶点信息的收集

通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）平台，以口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18为筛选条件，检索出柴胡、黄芩、葛根、山慈菇、两头尖、薏苡仁、木贼、大黄、甘草等药物的活性成分和对应靶点。通过Uniprot数据库，设定研究程度为reviewed、限定物种为Homosapiens为筛选条件，将收集到的活性成分靶点转化为相应的基因名称。

1.2痛风靶点收集

通过GeneCards数据库、OMIM数据库）、TTD数据库、DRUGBANK数据库，以“gout”为检索词进行检索，筛选收集痛风相关靶点，并将4个疾病数据库的结果进行整合。

1.3“活性成分–靶点”网络图的绘制

通过Veney2.1软件将祛痹痛风饮有效化合物靶点与痛风相关的疾病靶点进行映射构建韦恩图，交集靶点可能为祛痹痛风饮治疗痛风的关键靶点。对活性成分靶点和疾病靶点取交集，利用Cytoscape3.7.2软件绘制“活性成分–靶点”网络图，使用其内置工具NetworkAnalyzer计算出度值（degree），筛选出主要活性化合物。

1.4蛋白相互作用（PPI）网络的构建

通过String数据库在线平台构建交集靶点的PPI网络模型，蛋白种属设置为“Homosapiens”，基本设置选择分子作用并将最低相互作用阈值设为中等“mediumconfidence”(>0.4），其他参数保持默认设置，获得PPI网络。

1.5关键靶点基因功能注释和通路富集分析

通过DAVID数据库对交集靶点进行基因本体（GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，筛选P<0.05的通路，并将得到的通路经在线绘图软件：微生信应用气泡图及柱状图进行可视化。

2、结果

2.1成分及靶点收集

通过TCMSP平台以OB≥30%,DL≥0.18为筛选条件，检索柴胡、黄芩、葛根、山慈菇、两头尖、薏苡仁、木贼、大黄、甘草等药物的活性成分，共收集到活性成分191个，共收集到3364个靶点。利用Uniprot数据库对靶点进行基因名称转化得到266个靶点基因，去除未找到靶点基因的成分，共得到163个活性成分，其中有9个为共有成分，柴胡12个、黄芩32个、葛根3个、山慈菇3个、两头尖3个、薏苡仁6个、木贼9个、大黄7个、甘草88个，见表1。

2.2疾病共同作用靶点获取

通过TTD、DRUGBANK、OMIM和GeneCards数据库检索痛风的疾病相关靶点，并对各个数据库中得到的治疗靶点取并集、去重复项后，最后共获得1133个治疗靶点。将之前得到的祛痹痛风饮的作用靶点和痛风疾病靶点分别输入Venny2.1.0在线工具绘制韦恩图，取交集得到87个共同靶点，见图1。

2.3“活性成分–靶点”网络图的绘制

将祛痹痛风饮的中药化学成分及87个交集靶点导入Cytoscape软件（3.7.2版本）构建中药活性成分–靶点网络图，见图2。NetworkAnalyzer计算分析得到229个节点，1193条边，药物活性成分的平均度值为8.38，根据度值筛选出15个大于平均值的活性成分，见表2。

2.4PPI网络构建与分析

将87个祛痹痛风饮治疗痛风的共同靶点输入到String数据库，构建出共同靶点的PPI网络模型，见图3。该PPI网络共包含87个节点（即共同作用靶点），1416条节点连接线（连接线表示2个节点之间存在相互作用，粗细代表相互作用关系的强弱）。经计算分析，该网络平均度值为32.6，白细胞介素-6(IL-6）、血管内皮生长因子A(VEGFA）、肿瘤坏死因子（TNF）、前列腺素G/H合成酶2(PTGS2）、白细胞介素-1β（IL-1β）等节点的度值显著高于平均度值，可能为该网络关键靶点，见表3。

5GO富集分析

通过David数据平台对87个共同靶点进行GO富集分析，获得P<0.05的GO条目453个，其中生物学过程（BP）条目357个、细胞学组分（CC）条目32个、分子生物学功能（MF）条目64个，将P值由小到大排列，展示BP、CC和MF排名前10的条目，见图4。这87个共同靶点主要参与的生物学过程主要有药物反应（responsetodrug）、RNA聚合酶II启动子转录调控（positiveregulationoftranscriptionfromRNApolymeraseIIpromoter）、炎症反应（inflammatoryresponse）、细胞对脂多糖的应答（cellularresponsetolipopolysaccharide）、对脂多糖的应答（responsetolipopolysaccharide）、基因表达的正调控（positiveregulationofgeneexpression）、DNA转录的正调控（positiveregulationoftranscription,DNA-templated）、凋亡过程的负调控（negativeregulationofapoptoticprocess）、老化（aging）、血管生成（angiogenesis）等。

2.6KEGG信号通路富集分析

通过DAVID数据平台对87个共同靶点进行KEGG信号通路富集分析，根据P<0.05筛选到112条信号通路。根据P值由小到大排列，列出排名前20名的通路，见图5。87个共同靶点涉及到的信号通路类型主要有TNF信号通路（TNFsignalingpathway）、TOLL样受体信号通路（Toll-likereceptorsignalingpathway）、癌症相关通路（Pathwaysincancer）、NOD样受体信号通路（NOD-likereceptorsignalingpathway）、HIF-1信号通路（HIF-1signalingpathway）、T细胞受体信号通路（Tcellreceptorsignalingpathway）、NF-κB信号通路（NF-kappaBsignalingpathway）等。

3、讨论

根据祛痹痛风饮中药活性成分–靶点网络，利用Cytoscape分析度值较高的活性成分包括槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇、刺芒柄花素、木犀草素等。槲皮素是一种黄酮类化合物，研究表明[19,20]，槲皮素可抑制单钠尿酸盐晶体（MSU）引起的机械痛觉过敏、白细胞聚集、肿瘤坏死因子（TNF）-α和白细胞介素（IL)-1β的产生、炎症小体的激活、抗氧化剂水平的降低和炎症小体成分mRNA的表达，从而抑制炎症反应，以减轻患者疼痛感。山柰酚通过抑制诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和一氧化氮表达水平、抑制ERK、p38和JNK通路的激活、NF-βp65亚基的移位，减少炎症因子如TNF-α、白细胞介素-1等的产生而发挥抗炎作用，并具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌及预防心血管疾病等药理活性[21,22]。β-谷甾醇及豆甾醇均为植物甾醇，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、降低胆固醇、抗焦虑及抑郁、改善记忆等作用[23,24]。NLRP3炎性体可引起痛风性关节炎的急性发作，刺芒柄花素可抑制NF-κB信号通路的激活和NLRP3炎性小体的激活[25]。研究显示，木犀草素可通过下调Toll样受体（TLR）/MyD88/NF-κB通路减轻急性痛风性关节炎大鼠的炎症反应，抑制急性痛风性关节炎大鼠TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平，具有与秋水仙碱相当的抑制效果[26]。

通过PPI网络分析交集靶点发现，其中IL-6、血管内皮生长因子A(VEGFA）、TNF、前列腺素G/H合成酶2(PTGS2）、IL-1β等靶蛋白度值显著高于平均度值。IL-6是一种多功能细胞因子，在痛风性关节炎急性期呈明显高表达，能引起炎症急性期反应[27,28]，而且有研究发现，IL-6与痛风石、关节畸形的形成有关，并且可能作为痛风性关节炎的预后指标[29]。IL-1β在痛风的发病机制和急性痛风性关节炎的病理过程中起关键作用[30]，可增强巨噬细胞与粒细胞活性作用，能促进IL-6、TNF-α等炎性因子的分泌，加重炎症反应，造成软骨细胞外基质降解，引发关节功能障碍[31]。TNF-α作为重要的前炎症细胞因子，可以激活巨噬细胞、间质细胞，编码炎症相关细胞因子基因的启动子，诱发多细胞相互作用形成正反馈，使炎症迅速放大并且持续存在[32,33]。有研究表明，TNF拮抗剂不仅可以缓解痛风性关节炎的急性炎症反应，而且可以保证降尿酸治疗的实施[34]。PTGS2又称为环氧化酶（COX），前列腺素E2(PGE2）由花生四烯酸（AA）经COX转化而成，有助于产生IL-1β，这是痛风的重要中介因子[35]。环氧合酶-2(COX-2）抑制剂已被临床用于治疗痛风性关节炎[36]。三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2(ABCG2）是目前研究较多的尿酸转运蛋白，ABCG2可介导肾脏和肾外尿酸排泄，其功能障碍可引起高尿酸血症[37]。

从KEGG通路富集结果分析可知，祛痹痛风饮治疗痛风的关键通路主要涉及TNF信号通路、Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路、HIF-1信号通路、T细胞受体信号通路、NF-κB信号通路等。TNF信号通路及通路中的相关因子在炎症反应过程中发挥重要的调控作用。TLR是存在于免疫细胞膜上的一种模式识别体，参与机体免疫过程，可放大细胞信号级联反应，最终产生一系列炎性因子，引起炎症反应[38,39]。TLR2和TLR4是TLR家族的重要成员，尿酸盐晶体可以直接与单核巨噬细胞表面的TLR2和TLR4结合，通过MyD88激活下游转录因子如NF-κB，进而诱导IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等炎症细胞因子的表达。这些细胞因子可促进内皮细胞黏附因子的表达，进而导致更多的中性粒细胞聚集于尿酸盐结晶沉积部位，使炎性反应进一步放大[40]。NOD样受体（NOD-likereceptor,NLR）主要参与调控细胞免疫应答反应，维持宿主细胞内环境的稳态[41]，研究表明[42,43],NLRP3与痛风的发作相关，是痛风发生的危险因素，单钠尿酸盐晶体（MSU）可以激活NLRP3炎症小体，ASC是NLRP3炎性体重要组成部分，能够与Caspase-1CARD结构域结合使Caspase-1活化，进而活化IL-1β，造成炎症反应增强，使关节滑膜通透性增强，关节红肿，诱发急性痛风性关节炎。NF-κB信号通路是调节炎症和免疫的经典信号通路，NF-κB是TNF和TOll样受体信号通路下游的核因子，可诱导IL-6、IL-1β、TNF-α等炎症因子的产生从而促进炎症反应[44]。

综上所述，祛痹痛风饮治疗痛风是一个涉及多成分、多靶点、多通路的过程。祛痹痛风饮可能通过槲皮素、山柰酚、豆甾醇、木犀草素等活性成分，作用于IL-6、TNF、IL-1β、CXCL8、CCL2等靶点，调控Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路、NF-κB信号通路等多通路促进肾脏和肾外尿酸排泄、减少尿酸盐晶体的沉积，抑制炎症因子的释放减轻炎症反应来治疗痛风。由于本研究仅依托于网络数据库，未考虑中药的剂量、炮制、煎煮方法对有效成分的影响，预测结论可能有偏差，因此后期需要运用中药指纹图谱技术及生物学实验对所测的活性成分、靶点和通路进行验证，为后期药物研发及疾病治疗提供一定的理论依据。

参考文献：

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文章来源：李彦平,张榜,崔炎,梁鹏飞.基于网络药理学探讨祛痹痛风饮治疗痛风的作用机制[J].现代药物与临床,2021,36(09):1782-1793