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UPLC法测定建昌帮姜制厚朴主成分含量变化差异

2024-03-23 120 上传者：管理员

摘要：目的比较厚朴不同炮制品主成分含量差异，为优选厚朴优质饮片提供科学依据。方法用UPLCCLASS-H色谱(SyncronisC185μm, 150 mm×4.6 mm)。以乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)为流动相进行梯度洗脱，流速0.3 ml/min,柱温40℃,检测波长290 nm,并对厚朴不同炮制品中木兰花碱、和厚朴酚、厚朴酚等主成分含量比较分析。结果炮制厚朴与其他不同炮制品相比，其所含木兰花碱、厚朴酚、和厚朴酚含量从高到低分别为生品厚朴、姜制厚朴、姜煮厚朴。结论不同炮制方法会影响厚朴主成分的含量，此研究采用的成分分析方法稳定可靠，简单易行，可为深入研究厚朴奠定基础。

关键词：
厚朴
消痰
炮制方法
燥湿
超高效液相色谱法
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厚朴为木兰科植物厚朴(MagnoLia officinaLis Rehd.et WiLs)或凹叶厚朴(MagnoLia offcinaLis Rehd.et WiLs Rehd.et.WiLs)的干燥干皮、枝皮或根皮，主要分布于陕西、浙江、江西、甘肃、湖北、四川、贵州等地，其中四川、湖北、浙江为其主产地[1]。厚朴味苦、辛，归胃、脾、大肠、肺经，性温，具有行气、燥湿、消痰、消积、平喘之功效。厚朴经姜制后能够增强宽中和胃的能力，并可消除咽喉刺激感，常用治呕吐泻痢、脘腹胀满、痰饮喘咳、积滞便秘等证[2,3]。历代文献对厚朴的炮制方法均有记载，如汉代用去皮制法，唐代用姜汁制法。到了宋代，对厚朴姜制法有了更加详细的记载，提出“不以姜制，则棘人喉舌”之炮制理论，并创新性提出了新的炮制方法，如糯米粥制、生姜枣制等；明朝的姜汁炒制和煮制外，还采用酒制、煅制、姜蜜制和姜汁巴豆制等；清朝有醋炒记载[4]。现代常以姜汤煮、姜制、姜汁浸等法炮制，故现版《中华人民共和国药典》[1]中除了“厚朴”之外，也收载了“姜厚朴”。资料表明，厚朴主含木兰花碱、和厚朴酚、厚朴酚等有效成分[5]。因此，本研究以这3种成分为厚朴不同炮制品质量评价的指标，运用UPLC测定厚朴不同炮制品主要成分含量，目的是探讨不同炮制方法对其含量变化的影响，为深入研究厚朴炮制品变化及其作用机制提供数据支撑，也为优选其优质饮片提供科学依据。

1、仪器与试药

1.1仪器

AcouityUPLCCLAss超高效液相、KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、二两装高速中药粉碎机(瑞安市永历制药机械有限公司)、XW-80A旋涡混合器(上海精科实业有限公司)、TDL-80-2C低速离心机(上海安亭科学仪器厂)、药典筛(绍兴市上虞瑞志仪器厂)、十万分之一电子天平(现代中药制剂教育部重点实验室)、5 ml的一次性使用无菌注射器带针(圣光医用制品股份有限公司)、GZX-9076MBE电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)、SHZ-DIII循环水真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)。

1.2试剂

乙腈(纯度：色谱纯，安徽天地超纯溶剂有限公司)、超纯水(南昌哇哈哈食品有限公司)、甲醇(纯度：色谱纯，安徽天地超纯溶剂有限公司)、甲酸(批号：1101181,西陇科学股份有限公司)、甲醇(批号：B2210111,西陇科学股份有限公司)。

1.3试药

厚朴酚对照品(批号：MUST-21030614,纯度：99.90%,成都曼思特生物科技有限公司)、和厚朴酚对照品(批号MUST-21030111,纯度：99.37%,供含量测定用，成都曼思特生物科技有限公司)、木兰花碱对照品(批号：wkq-21022608,纯度：≥98%,四川省维克奇生物科技有限公司)。中药厚朴、生姜，均购于安徽惠仁堂中药饮片有限公司,两者经江西中医药大学中药鉴定室刘应姣副教授鉴定为正品。

2、方法与结果

2.1厚朴炮制品的制备

2.1.1厚朴生品

取原药材，刮去粗皮，洗净，润透，切丝，晒干，备用。

2.1.2姜制厚朴

依照建昌帮制法：取原药材，用清水洗净灰屑，除去杂质，竖放入竹编内；再用湿抹布闷润，至内外湿润均匀时，刮去外表粗皮；将其切片晾干，置缸内；缸中加入定量姜汁(每100 kg厚朴，配12 kg生姜榨汁，掺水12 kg),拌匀后闷润1～2 d,取出晾至六成干，之后置于热锅内，文火炒至棕褐色约九成干时，取出厚朴，筛去灰屑，晾干即得，备用。

2.1.3姜煮厚朴

将生姜洗净切成片置于的锅中加适量清水，煮成姜汁，之后将厚朴置于姜汁中文火加热共煮，至锅中姜汁被厚朴将吸尽，取出厚朴晾凉，切细丝，晾干即得，备用。

2.2供试品溶液的制备

精密称取样品1粉末2.000 g,装入15 ml的EP管中，首次提取加入50%甲醇水溶液5.5 ml,旋涡混合5 min,待溶剂被吸尽后，再加入适量50%甲醇溶液，常温下超声提取30 min,取出，置离心机中(3000 r/min),离心10 min,倾取上清液，置10 ml容量瓶中。连续反复提取3次(第2、3次添加溶剂量约3.5 ml),将3次提取液合并后，置10 ml容量瓶中定容。3种样品均以此法制备并冷藏保存。

2.3对照品的制备

精密称定木兰花碱、和厚朴酚、厚朴酚对照品适量，分别置于EP管内，各加入甲醇1 ml,超声5 min,摇匀，即可。

2.4混合对照溶液的制备

精密称取1.14 mg木兰花碱、1.15 mg厚朴酚、1.16 mg和厚朴酚对照品，共同置于10 ml容量瓶内，以甲醇溶液将3者溶解并定容。分别精密吸取120、120、500μl的3种对照品混合储备液，将其置于离心管中，滴加甲醇溶液100μl,制备成1.14、1.15、1.16 mg/ml的3种不同浓度的混合对照品溶液。

2.5方法学考察

2.5.1色谱条件

SyncronisC18UPLC-H色谱柱(Dim 150 mm×4.6 nm, 5um),流动相乙腈(A)-0.1 %甲酸水(B)梯度洗脱(0～35 min, 5%～45 %A;35～50 min, 45 %～70 %A),流速0.3 ml/min,进样量2μl,柱温40℃,在290 nm波长检测。见图1。

图1厚朴UPLC色谱图

2.5.2线性关系的考察

精密吸取混合对照品溶液1 ml,按“2.5.1”项下色谱条件对其进样分析，连续进样6次，进样量为0.5～3μl,设横坐标为进样浓度(μg/ml),纵坐标为峰面积，得线性回归方程和标准曲线。见表1。

表1线性关系考察结果

2.5.3精密度考察

精密吸取对照品混合溶液1 ml,相同测定条件下，连续进样6次，记录峰面积。结果得精密度RSD分别为0.818%(木兰花碱)、0.496%(厚朴酚)、0.493%(和厚朴酚),三者均小于3%,表明该仪器精密度良好。

2.5.4稳定性考察

取厚朴生品供试品溶液，分别于配制后0、2、4、8、12、24 h按“2.5.1”项下色谱方法，并测定其峰面积，计算RSD值。结果显示，三者峰面积变化不大，RSD值分别为1.455%(木兰花)、1.230%(厚朴酚)、2.027%(和厚朴酚),均小于3%,表明样品在24 h内稳定性良好。

2.5.5重复性考察

精密称取同一供试品6份，按“2.5.1”项下色谱方法测定峰面积，计算RSD值。三者标准差分别为627.34(木兰花碱)、7147.57(和厚朴酚)、48662.03(厚朴酚)。RSD分别为2.938%(木兰花碱)、2.377%(和厚朴酚)、2.302%(厚朴酚),三者均小于3%,表明本法重复性良好。

2.5.6加样回收率考察

称取生品厚朴供试品适量，精密称定，加入1.14 mg木兰花碱、1.15 mg厚朴酚、1.16 mg和厚朴酚的混合对照品适量，按2.3项下的条件制备供试品溶液，按2.5.1项下的色谱条件进样测定，计算加样回收率。见表2。

2.5.7样品的含量测定

精密取各种厚朴制剂(不同批次),各取3份，并精密称定每份约1.000 g,依据“2.3”项的方法制备供试品溶液，照“2.5.1”项色谱方法进行测定，并计算3种主要化学物质的百分含量。见表3。

表2加样回收率考察结果

表3厚朴样品中3种成分的含量测定

3、讨论

厚朴的炮制有炒制、盐炒、煮制、酥制、醋制、酒浸炒、姜汁浸后炒干等，现代炮制方法多为姜汤煮、姜制、姜汁浸等。目前《中华人民共和国药典》[1]收载了“姜厚朴”,而厚朴姜制法也是江西建昌帮特色炮制法，其使用辅料和炮制方法与《中华人民共和国药典》[1]所载的姜厚朴制法有明显差异。为此，以建昌帮特色炮制法做的姜厚朴为研究对象，并与其他厚朴炮制品进行有效成分比较，以厚朴主要成分木兰花碱、厚朴酚、和厚朴酚为质量评价指标，探讨不同炮制方法对厚朴主要有效成分含量变化的影响，为建昌帮姜厚朴中药饮片炮制的合理性提供科学依据。

本研究选择木兰花碱、厚朴酚、和厚朴酚为厚朴不同炮制品的成分变化指标。其主要依据是这些具有明显的生物活性。药效研究证实，厚朴酚、和厚朴酚均具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗肿瘤等作用，并具抗抑郁、抗癫痫、抗脑缺血、抗痴呆等多种作用[6,7]。此外，厚朴酚还可改善胃肠运动障碍，和厚朴酚具有保肝功能；而木兰花碱作为一种存在于厚朴中的重要生物碱，同厚朴酚以及和厚朴酚一样，具有抗炎、抗氧化作用，并具有抗心律失常和降压等活性作用[8,9,10]。

本研究结果表明，姜制厚朴，与其他厚朴炮制品所含木兰花碱、厚朴酚、和厚朴酚的含量分别为：生品厚朴(10.87%、11.06%、8.83%)、姜制厚朴(10.78%、8.14%、5.95%)、姜煮厚朴(11.03%、7.87%、3.13%)。说明炮制对其成分含量产生影响。与生品相比，建昌帮姜厚朴中厚朴酚、和厚朴酚等成分含量明显降低，姜煮厚朴的厚朴酚、和厚朴酚含量最低，说明辅料姜和加热等因素会影响厚朴酚、和厚朴酚的溶出，其中姜煮对厚朴的影响明显更高。

综上，不同炮制方法对厚朴主要有效成分含量产生的影响不同，其中影响最大者为木兰花碱，其次是厚朴酚、和厚朴酚。在含量变化方面，厚朴经过姜制，厚朴酚以及和厚朴酚都有一定程度的降低，姜煮厚朴下降更明显，而木兰花碱炮制前后含量变化不显著。望此结果为今后厚朴的药物研究提供参考。

参考文献:

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基金资助:江西省中医药管理局科技计划项目(No.SZYYB20224279);