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新型紫杉醇纳米粒的构建及其体外表征

2023-12-18 103 上传者：管理员

摘要：目的制备紫杉醇/明胶接枝环糊精(Gel-CD)/聚乙二醇2000维生素E琥珀酸酯(TPGS-2000)载药纳米粒，并对其性质及体内分布进行考察。方法采用探头超声波法制备紫杉醇纳米粒，测定其粒径、PDI、Zeta电位、包封率及载药量；采用扫描电镜观察纳米粒的形态；动态透析考察药物的体外释放情况；HPLC法测定药物在小鼠体内的分布情况。结果紫杉醇纳米粒的平均粒径为367.5±1.35 nm, PDI为0.254±0.08,Zeta电位为-6.54±0.05 mV,包封率为83.62%±6.76%,载药量为6.38%±0.29%;外观为乳白色近球形，大小分布均匀；144 h的累积释放率约86%。紫杉醇纳米粒可减少紫杉醇在心脏组织的分布，降低其不良反应。结论紫杉醇/Gel-CD/TPGS-2000纳米粒性质优良，具有明显的缓释效果，可降低紫杉醇的心脏不良反应，为紫杉醇新制剂的研发提供了新思路。

关键词：
体内分布
体外表征
制备工艺
明胶接枝环糊精
紫杉醇
纳米粒
聚乙二醇2000维生素E琥珀酸酯
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紫杉醇为三环二萜类化合物，对乳腺癌、卵巢癌、肝癌等具有较高的抗肿瘤活性，是临床常用抗肿瘤药物[1]。目前已上市的紫杉醇纳米制剂(紫杉醇脂质体、紫杉醇白蛋白)在一定程度上提高了紫杉醇的水溶性和安全性，实现了紫杉醇给药途径的多样化，但对紫杉醇在正常组织如心脏中的毒性及临床治疗效果的改善程度有限。因此，寻找新的功能性载药体系(如智能响应型纳米药物载体),实现药物在肿瘤组织的聚集，提高疗效、降低不良反应，仍是目前的首要任务[2,3,4]。明胶为基质金属蛋白酶(MMPs)的底物，可通过与明胶酶特异性结合而富集于MMPs过表达的肿瘤细胞处，具有药物靶向作用[5]。紫杉醇的水溶性极差，β-环糊精具有边缘亲水内腔疏水的特点，可与紫杉醇形成包合物提高其在水中的溶解度[6]。明胶接枝环糊精(Gel-CD)结合了两种载体的特点，既具有靶向性也能提高药物的溶解度。聚乙二醇2000维生素E琥珀酸酯(TPGS-2000)是常见的P-糖蛋白(P-gp)抑制剂，可逆转P-gp过度表达引起的肿瘤多药耐药性(MDR),提高化疗药物的疗效[7]。现以Gel-CD、TPGS-2000为载体制备新型紫杉醇纳米粒，并对其性质和体内组织分布进行考察，为靶向抗肿瘤药物新制剂的研究提供思路。

1、实验部分

1.1 仪器与试药

LC2030-Plus高效液相色谱仪(日本岛津);Zetasizer Nano激光粒度测定仪(英国马尔文)。紫杉醇原料药(西安瑞林生物科技有限公司，纯度：98%);紫杉醇对照品(上海麦克林生化科技股份有限公司，纯度：99%);紫杉醇注射液(泰素，百时美施贵宝公司);β-环糊精(国药集团化学试剂有限公司);聚乙二醇2000维生素E琥珀酸酯(TPGS-2000)、明胶(阿拉丁控股集团有限公司);明胶接枝环糊精(Gel-CD,自制);甲醇、乙腈为色谱纯。

1.2 方法与结果

1.2.1 紫杉醇纳米粒制备工艺的优化

精密称取9份Gel-CD 20 mg, 分别置于10 mL烧杯中，加入0.8 mL 5 mg·mL-1的TPGS-2000水溶液，于室温下磁力搅拌溶解后，缓慢滴加4 mg·mL-1紫杉醇乙醇溶液各0.5、1、1.5 mL,搅拌过夜，旋蒸除去乙醇，加纯水至4 mL,用超声波细胞破碎仪探头超声10 min(超声2 s/间隙2 s, 下同),于4×103 r·min-1离心6 min, 测定包封率。结果表明：紫杉醇加入量为2、4、6 mg时，紫杉醇纳米粒的包封率分别为69.93%±1.93%、52.96%±2.44%、45.68%±1.96%,平均包封率随紫杉醇加入量的增加而降低。因此，选择紫杉醇加入量为2 mg。精密称取20 mg Gel-CD,共9份，置10 mL烧杯中，分别加入5 mg·mL-1的TPGS-2000水溶液0.4、0.8、1.2 mL,室温下搅拌溶解后，缓慢滴加4 mg·mL-1紫杉醇乙醇溶液0.5 mL,搅拌过夜，旋蒸除去乙醇，加纯水至4 mL,超声10 min, 于4×103 r·min-1离心6 min, 测定包封率。结果表明：TPGS水溶液加入量为0.4、0.8、1.2 mL时，纳米粒的包封率分别为47.00%±0.99%、69.93%±1.93%、70.86%±2.38%。TPGS-2000水溶液加入量为0.8、1.2 mL时，紫杉醇纳米粒的平均包封率无显著性差异(P>0.05),且均高于0.4 mL时。因此，选择TPGS-2000水溶液加入量为0.8 mL。精密称取20 mg Gel-CD,共9份，分别置10 mL烧杯中，加入5 mg·mL-1的TPGS-2000水溶液0.8 mL,室温下搅拌溶解，缓慢滴加4 mg·mL-1紫杉醇乙醇溶液0.5 mL,搅拌过夜，旋蒸除去乙醇，加纯水至4 mL,分别超声5、10、15 min, 于4×103 r·min-1离心6 min, 测定包封率。结果表明：超声时间为5、10、15 min时，纳米粒的包封率分别为41.31%±2.17%、69.93%±1.93%、68.83%±3.16%。超声10、15 min时，纳米粒的平均包封率无显著差异(P>0.05),且均较超声5 min时高。为节约时间，选择超声10 min。综上，优化后的制备工艺为：精密称取紫杉醇原料药40 mg, 置10 mL量瓶中，用无水乙醇定容，得4 mg·mL-1紫杉醇乙醇溶液。精密称取20 mg载体材料Gel-CD,加入5 mg·mL-1的TPGS-2000水溶液0.8 mL,于室温下搅拌溶解后，缓慢滴加4 mg·mL-1紫杉醇乙醇溶液0.5 mL,搅拌过夜，旋蒸除去乙醇，加纯水至4 mL,超声10 min, 于4×103 r·min-1离心6 min, 取上清液，即得紫杉醇纳米粒。紫杉醇纳米粒溶液为乳白色半透明液体，具有蓝色乳光(图1)。

图1 紫杉醇纳米粒(左)和空白溶液(右)

1.2.2 粒径与Zeta电位的测定

取按照最佳工艺制备得到的紫杉醇纳米粒1 mL,置10 mL量瓶中，定容，用激光粒度测定其粒径及Zeta电位。紫杉醇纳米粒的粒径为367.5±1.35 nm, PDI为0.254±0.08,Zeta电位为-6.54±0.05 mV,表明纳米粒的粒径大小分布均匀(图2)。

图2 紫杉醇纳米粒的粒径分布(A)和Zeta电位(B)

1.2.3 含量的测定方法

参照2020年版《中国药典》二部中紫杉醇含量测定项下的规定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为甲醇-水-乙腈(23:41:36),检测波长227 nm, 流速1.0 mL·min-1,进样量10 μL。取紫杉醇纳米粒适量，精密称定，置100 mL量瓶中，以乙腈为溶剂，配制成0.12 mg·mL-1的供试品溶液；另取紫杉醇对照品适量，精密称定，同法制备浓度为0.12 mg·mL-1的对照品溶液；精密吸取上述对照品溶液适量，用乙腈稀释为0.1、1、4、10、14、16、20、24 μg·mL-1的线性工作溶液，按上述色谱条件分别进样测定。以紫杉醇浓度(μg·mL-1)为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归，得回归方程为：Y=2.0751×104X+1.2630×103(r2=0.9999),0.1～24.0 μg·mL-1紫杉醇与峰面积的线性关系良好。

1.2.4 包封率与载药量的测定

精密量取“1.2.1”项中离心前的紫杉醇纳米粒及离心后的紫杉醇纳米粒上清液各1 mL,分别加入10 mL甲醇中，超声破纳米粒，离心，取适量上清液测定紫杉醇的含量。包封率=M/M0×100%,式中，M0为离心前制剂中紫杉醇的含量；M为离心后制剂上清液中紫杉醇的含量。计算得紫杉醇纳米粒的包封率为83.62%±6.76%。采用重量法测定紫杉醇纳米粒的载药量，精密量取3份紫杉醇纳米粒1 mL,另精密量取3份未加紫杉醇的纳米粒1 mL,置干燥西林瓶中，冷冻干燥后称重。载药量=(M2-M1)/M2×100%,式中，M1为空白纳米粒冻干后的质量；M2为紫杉醇纳米粒冻干后的质量。计算得紫杉醇纳米粒的载药量为6.38%±0.29%。

1.2.5 扫描电镜(SEM)

取适量紫杉醇纳米粒冻干粉末适量，放于导电胶上固定，用洗耳球吹去多余的试样，真空条件镀一层100～150A金属膜，于SEM下观察紫杉醇纳米粒的形态。紫杉醇纳米粒近球形，大小均一(图3)。

图3 紫杉醇纳米粒的SEM图

1.2.6 紫杉醇体外释放率的测定

采用动态透析法测定紫杉醇原料药和紫杉醇纳米粒在透析袋中的药物释放情况。分别取紫杉醇原料药和紫杉醇纳米粒适量，以释放介质为溶剂配制浓度为200 μg·mL-1的溶液，精密量取2.0 mL置透析袋中，系紧两端，将透析袋放入30 mL pH7.4磷酸缓冲液-乙醇(70:30)为释药介质中透析，转速70 r·min-1,于0.5、1、2、3、5、7、24、48、72、96、144 h取样0.5 mL,并补充等温等体积的释放介质，按“1.2.3”项下HPLC法测定紫杉醇的含量。由图4可知：紫杉醇原料药在7 h时基本释放完全；而紫杉醇纳米粒在7 h的累积释放率约5%,在144 h的累积释放率约达86%。表明紫杉醇纳米粒具有明显的缓释特性。

图4 紫杉醇原料药和纳米粒的体外累积释放率

1.2.7 紫杉醇在小鼠体内的分布

取24只小鼠，随机均分为4组，紫杉醇纳米粒和紫杉醇注射液各两组，禁食12 h后经尾静脉注射给予相应药物，给药剂量为6 mg·kg-1,分别在给药后15、60 min时处死小鼠，立即解剖取出心、肝、脾、肺、肾组织。取各组织200 mg, 加氯化钠600 μL,研磨成匀浆后，加入甲醇1 mL涡旋，离心，取上清液，HPLC法测定各组织中紫杉醇的含量，并计算其浓度。由图5可知：肝组织中的紫杉醇浓度最高，且与心、脾、肺、肾组织中的药物浓度有极显著差异(P<0.01),且纳米粒组高于注射液组。紫杉醇可抑制肝癌HepG2细胞的增殖并诱导其凋亡，纳米粒能将更多的紫杉醇递送到肝组织，可为肝肿瘤的治疗提供思路[8]。

图5 紫杉醇注射液和纳米粒在各组织的分布

2、讨论

文中用探头超声法成功制备了紫杉醇/明胶接枝环糊精(Gel-CD)/聚乙二醇2000维生素E琥珀酸酯纳米粒，性质优良。紫杉醇纳米粒在pH7.4磷酸缓冲液-乙醇介质中144 h的累积释放率约86%,具明显缓释行为。紫杉醇作为疏水性药物更倾向于分布在Gel-CD中CD的内部形成包合物，因而释药缓慢。体内分布实验表明：紫杉醇纳米粒在心脏和肾脏组织中的浓度明显低于注射液组，而紫杉醇注射液对心脏和肾脏有较强的不良反应[9]。紫杉醇制备成纳米粒后在心脏和肾脏的分布减少，进而可降低对心脏和肾脏的不良反应。此外，紫杉醇纳米粒在肝组织中浓度较高，这可能是因为制剂的被动靶向作用使药物在肝组织中聚集[10]。因此，紫杉醇纳米粒对于肝脏部位的肿瘤可能有更好的治疗效果。文中结果可为紫杉醇新制剂的开发提供新思路，是研发抗肿瘤药物特别是抗肝癌药物的一个重要突破口。

参考文献:

[4]王雪瑜,许璺文,全卓伟,等.共载胡椒碱和紫杉醇白蛋白纳米制剂的制备[J].华西药学杂志,2023,38(3):258-263.

[5]马维东,王彤彤,朱启航,等.外泌体中circ-0044366调控肿瘤相关成纤维细胞MMP2的表达促进结直肠癌转移的机制研究[J].中国癌症杂志,2021,31(5):397-407.

[6]姜伟伟,杨华.载紫杉醇pH敏感环糊精胶束的制备及体外释放研究[J].现代化工,2018,38(12):77-81.

[10]唐颖楠.中药肝靶向固体脂质纳米粒载药系统的研究进展[J].广东化工,2021,48(24):4-5.

基金资助:国家自然科学基金资助项目(批准号:82060806);江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室开放基金项目(zdsys-202207);中医药生物新材料关键技术研究与智能装备开发学科交叉创新团队项目(GZKJ2303);广西中医药大学研究生教育创新项目(YCSZ2022008);广西中医药大学大学生科研训练课题(2021DXS09);广西中医药大学大学生创新创业训练计划项目(S202210600053; S202310600107);

文章来源:陈金清,黄国颖,李广铨等.新型紫杉醇纳米粒的构建及其体外表征[J].华西药学杂志,2023,38(06):599-602.