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胃癌细胞中THOR的表达水平及对胃癌细胞干性的影响

2020-07-22 291 上传者：管理员

摘要：目的:探究睾丸相关的高保守的致癌长链非编码RNA(THOR)在胃癌细胞中的表达及对胃癌细胞干性的影响。方法:收集徐州医科大学附属医院36对胃癌及癌旁正常组织标本，进行相关细胞培养、细胞活力测定、实时荧光定量PCR、慢病毒包和稳定的细胞株构建、mRNA稳定性分析、细胞球形形成分析、RNA测序分析、ALDH1活动分析，并对实验数据进行对比分析。结果:RNA测序分析发现胃癌组织中THOR水平较癌旁正常组织明显上调(P<0.01)。随着THOR的稳定敲除，胃癌细胞中的干性标志物(ALDH1,Nanog,Oct1,Oct2,Oct4,SOX2,SOX9,CD44)的表达显著降低(均P<0.01)。并且THOR的敲除降低了胃癌细胞形成球状体的能力，表现为球体尺寸变小和数量减少(P<0.01)。结论:THOR在胃癌细胞中的表达显著升高，敲除THOR可以降低胃癌细胞的干性。THOR与胃癌细胞中的干性标志物之间具有明显的作用关系，THOR可能是胃癌治疗的一个新的靶点。

关键词：
THOR
干性
肿瘤
胃癌细胞
长链非编码RNA
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近年来，早期胃癌发现率有所提高，积极改进和规范手术方法以及应用综合治疗使胃癌的预后有所改善，但大多数胃癌的5年生存率仍徘徊于20%～30%[1]。随着肿瘤分子生物学研究的不断深入，分子靶向治疗为胃癌的治疗提供了新的思路。因此，寻找新的靶点对胃癌分子靶向治疗的开展具有重要意义。

长链非编码RNA是长度大于200个核苷酸的非编码RNA，许多研究表明lncRNA在肿瘤的发生中具有重要的作用[2]。研究发现，lncRNAHNFIA-ASI在原发性食道癌中显著表达，敲除HNFIA-ASI能够显著抑制原发性食道癌细胞增殖，使其停滞在细胞周期的S期，并且细胞的迁移和侵袭也受到了抑制[2]。此外，lncRNA在其他疾病中亦起着重要的作用。相关研究表明，睾丸相关的高保守的致癌长非编码RNA不仅能够促进人骨肉瘤细胞在体外和体内的生长，还能促进人肾癌细胞的生长，也能通过增强细胞干性，降低鼻咽癌细胞顺铂敏感性[3,4,5]。

癌症干细胞能够自我更新，而且能产生异质性的肿瘤。CSCs还具有无限增殖能力，可以维持肿瘤细胞群的活力。此外，CSCs长期处于休眠状态，对于化疗具有耐药性。因此，CSCs的自我更新和治疗抵抗等特性被认为是癌症发生、发展、耐药和复发的根本原因[6]。除了发现THOR在正常的睾丸组织中表达之外，Hosono等[7]还发现如果抑制THOR在肿瘤细胞中的表达，肿瘤生长就会减慢。当THOR过表达，肿瘤细胞则更快地生长。

THOR对癌症的发生、发展有影响，但其在胃癌进展中所起的作用及其机制尚不清楚。本研究旨在探究THOR与调节胃癌细胞干性标志物之间的作用关系，为开发特异性的分子靶向药物提供理论依据和方向，现报道如下。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1临床标本

收集徐州医科大学附属医院36对胃癌及癌旁正常组织标本。获得所有患者的书面知情同意和医院伦理审查委员会的批准。胃癌细胞系AGS,BGC-823,MKN-45,MGC-803,SCG-7901及正常胃上皮细胞系gs-1均购自中国科学院细胞库。

1.2方法

1.2.1细胞培养

SCG7901顺铂耐药细胞(SCG7901-ddp)(购自中国南京凯健生物科技有限公司)。所有的细胞系培养在37℃含有5%CO2的湿大气中，并在1640培养基中培养(美国Gibco)，培养基中补充10%胎牛血清(Gibco),80U/ml青霉素和0.08mg/ml链霉素。

1.2.2实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

采用qRT-PCR检测基因mRNA水平。采用TRIeasyTM总RNA提取试剂TRIeasyTM，按照制造商的推荐，从组织和细胞中提取总RNA。根据标准程序，用HifairTMⅡ第一链cDNA合成试剂盒(YEASEN)反向转录互补DNA(cDNA)。在ABIPrism7500检测系统(美国AppliedBiosystems公司)上用HieffUniconaqMan多重qPCR主混合物(YEASEN)检测mRNA水平。GAPDH作为内部参考。采用2-△△ct法计算mRNAs的相对表达。

1.2.3慢病毒载体构建及包装

THOR的基因敲除和THOR的过表达病毒载体均由RIBOBIOInc公司构建和包装，命名为Lenti-THOR-shRNA和Lenti-THOR。在2μg/ml聚凝胺条件下，用Lenti-THOR-shRNA病毒或对照病毒，分别感染胃癌细胞MKN-45和BGC-823细胞，以构建稳定的THOR基因敲除细胞。48h后，用1.5μg/ml嘌呤霉素(Sigma)筛选细胞3周。

1.2.4mRNA稳定性分析

用Lenti-THOR-shRNA感染胃癌细胞48h后，THOR被敲除。然后在培养基中加入5μg/ml的ActD，阻断从头合成RNA。在指定时间点采集总RNA，并且用qRT-PCR检测mRNA表达。

1.2.5细胞球形形成分析

胃癌细胞球状体的形成是在不依赖于锚固的甲基纤维素(Sigma)条件下进行的。简言之，采用不同治疗方法的胃癌细胞用胰蛋白酶EDTA(Sigma)消化，然后用MammoCultTM人培养基试剂盒(Cat#05620,STEMCELLTechnologies，温哥华，加拿大)在500个细胞/孔的超低附着24孔板中培养。培养10d后，用装有直尺的显微镜检测和拍摄非黏附球体的数量和大小。计算大于50μm的球体。本实验一式3份，独立重复至少3次。

1.2.6RNA测序分析(RNA-seq)

进行RNA-seq分析，检测胃癌组织中异位表达的lncRNA。然后通过慢病毒感染胃癌细胞，稳定敲除THOR，测量胃癌细胞中的干性标志物的表达，与未敲除THOR胃癌细胞(对照组)进行比较，采用qRT-PCR方法评价THOR的敲除效率。采用RNA荧光原位杂交技术(RNA-FISH)分析胃癌组织及癌旁正常组织中THOR的表达，检测胃癌细胞和正常胃上皮细胞中THOR水平。由药明康德公司(无锡，中国)进行本实验。

1.2.7ALDH1活动分析

按照标准程序，使用ALDEFLUORTM试剂盒(Cat#KA3742,STEMCELLTechnologies)测定ALDH1活性。

1.2.8细胞活力测定

用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)对细胞增殖能力进行评价。不同处理的细胞以4000个细胞/孔接种在96孔板中，随后进行顺铂处理(5μM,Cat#S1166,Selleck.cn)。1～3d后检测细胞能力。对每种分析进行3次试验。

1.3统计学分析

采用SPSS19.0统计学软件对数据进行处理，所有数据均来自至少3个独立实验(n≥3)。计量资料符合正态分布以表示，比较采用单因素方差分析和Tukey-Kramer后检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1THOR在胃癌组织和正常邻近组织中的表达比较

RNA-seq分析结果显示，胃癌组织中THOR水平较癌旁正常组织明显上调，qRT-PCR和RNA-FISH在胃癌组织中得到的结果一致(P<0.01)。胃癌细胞(特别是MKN-45和BGC-823细胞)和正常邻近组织中THOR的表达情况结果一致(P<0.01)。见表1。

表1RNA-seq分析THOR在胃癌组织和正常邻近组织中的表达结果比较

2.2敲除THOR组和对照组胃癌细胞的干性标志物表达比较

RNA-seq分析结果显示干性标志物在敲除THOR和未敲除THOR的MKN45细胞中均有表达。随着THOR的稳定敲除，胃癌细胞中的干性标志物(ALDH1,Nanog,Oct1,Oct2,Oct4,SOX2,SOX9,CD44)的表达显著降低(均P<0.01)。利用qRT-PCR进一步验证具备干性的细胞的表达变化，得到一致的结果(P<0.01)。此外，THOR的敲除降低了胃癌细胞形成球状体的能力，表现为球体尺寸变小和数量减少(P<0.01)。与此一致的是，通过ALDEFLUORTM工具测量显示，THOR的敲除显著降低了胃癌细胞MKN-45和BGC-823中ALDH1的活性(P<0.05;P<0.01)。结果表明，敲除THOR可以降低胃癌细胞的干性。见表2。

表2RNA-seq分析敲除THOR组和对照组胃癌细胞的干性标志物的表达结果比较

3、讨论

lncRNA是一类具有未知生物学功能的转录本。既往研究表明，lncRNA可以通过转录和转录后调控，与染色质、DNA、RNA和蛋白质相互影响来发挥作用[8,9,10]。此外，我们发现敲除THOR可使胃癌细胞中的干性标志物(ALDH1,Nanog,Oct1,Oct2,Oct4,SOX2,SOX9,CD44)明显降低，提示THOR增强了mRNA的稳定性，突出了lncRNA在增加RNA稳定性中的作用，这与之前的研究一致[11]。相关研究表明，lncRNA可以通过稳定某些抑癌基因mRNA以及蛋白来促进癌细胞的生长发育以及转移[12]。近年发现，RNA结合蛋白HuR与细胞增殖、肿瘤相关的炎症和血管生成密切相关，提示HuR可能参与了肿瘤发生、发展和转移过程。如Heinonen等[13]发现，在非BRCA1/2突变的乳腺癌患者中，胞质HuR的阳性率为39.4%，并与雌激素受体阴性、孕激素受体阴性和淋巴结转移密切相关。Lim等[14]研究了结肠癌中COX-2和HuR的表达情况，发现胞质HuR表达在31.6%的肿瘤组织中，不仅与COX-2表达呈正相关，而且与淋巴管侵犯和淋巴结转移密切相关。因此，RNA结合蛋白是否参与了THOR介导的胃癌干细胞的干性调控，以及THOR、miRNA和RNA结合蛋白之间的串扰有待进一步研究。

本研究采用RNA-seq分析结果显示，THOR在胃癌组织和细胞中表达显著升高。进一步的功能实验表明，敲除THOR可以降低胃癌细胞干性，THOR的敲除可以降低胃癌细胞形成球状体的能力，表现为球体尺寸变小和数量减少。提示THOR与胃癌细胞中的干性标志物(ALDH1,Nanog,Oct1,Oct2,Oct4,SOX2,SOX9,CD44)之间具有明显的作用关系，THOR可能是胃癌治疗的一个新的靶点。

参考文献：

[1]秦叔逵,龚新雷.晚期胃癌化疗的现状和新进展[J].临床肿瘤学杂志,2006,11(9):641-652.

[2]尹艳桃,倪亚光,覃丽.lncRNA在肿瘤中的表达及作用机制[J].中国生物化学与分子生物学报,2015(4):27-34.

许雁晗,宋虎,宋军,宗启言,邹钰,李想,辛科.THOR在胃癌细胞中的表达及对胃癌细胞干性的影响[J].现代临床医学,2020(04):249-252.