菌群耐药已经成为目前临床上亟待解决的关键问题，其中革兰阴性杆菌引起的感染和耐药问题尤为突出。革兰阴性杆菌是临床常见的条件致病菌，主要包括铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌及大肠埃希菌等[1]。长期以来碳青霉烯类药物在治疗由革兰阴性杆菌导致的细菌严重感染中发挥了不可替代的作用，但近年来，由于过量、不正确地预防性使用抗菌药物以及为家畜使用抗菌药物等原因，革兰阴性杆菌耐药事件的发生和由其引起的感染不断增加[2,3]。此外，除了碳青霉烯类抗菌药物外，治疗革兰阴性杆菌感染的药物非常有限。一旦革兰阴性杆菌对碳青霉烯类药物产生耐药，将会导致患者的病程延长和死亡风险的增加。因此，在没有新型抗菌药物和新的治疗选择以前，加强细菌耐药监测，加深对细菌耐药机制的了解在应对碳青霉烯类药物耐药威胁方面具有重要的指导意义。本文就此方面相关研究进展进行综述。

1、碳青霉烯酶的产生

碳青霉烯类抗菌药物耐药的主要原因是碳青霉烯酶，它能水解包括碳青霉烯类在内几乎所有的β内酰胺类抗菌药物[4]。根据Ambler分类法可将碳青霉烯酶分为A、B、C和D4大类。其中，A、B和D类可水解碳青霉烯类药物活性，被称为碳青霉烯酶，A、C和D类活性位点含有丝氨酸残基，又称为丝氨酸碳青霉烯酶;B类需要二价锌离子或者其他重金属离子来催化保持活性，也称为金属β内酰胺酶(MBLs)[5]。

1.1A类碳青霉烯酶

A类碳青霉烯酶有多种类型，其中对肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)的研究较为广泛，目前已发现的KPC共有22种亚型，西方国家以KPC-3型为主，我国则以KPC-2型为主。KPC是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物产生耐药性的主要原因。KPC酶基本上是由质粒编码介导的，可以在细菌之间互相传播[6]。KPC基因一般嵌入一种基于Tn3D的转座子Tn4401上，Tn4401可分别插在位点不同、大小不同以及不相容性的质粒上，能高频率地移动碳青霉烯酶编码基因。Tn4401转座子使blaKPC-2基因能够方便地在质粒间传递，编码blaKPC的质粒一般还会携带喹诺酮类、四环素类、氨基糖苷类等其他的耐药基因，在同种或者不同种菌株之间进行传播。流行病学研究显示，转座子Tn4401是欧美等国家地区最常见的携带有blaKPC的基因元件[7]，我国流行的转座子Tn1721是以IRR-tnpA-tnpR-IRL1-IRL2的结构出现，而非最初推测的Tn1721-Tn3[8]。既往实验推断可能存在未捕获的质粒，例如与供体质粒相同的质粒及和Tn1721A转座子运动模式类似的供体和靶质粒融合而成的含有重复复制Tn1721的共整合体[9]。由此可见，blaKPC能通过转座子在同一宿主内共存的质粒之间进行传播，也可以通过质粒整体的移动水平转移。因此，产KPC的细菌通常表现为多重耐药及广泛耐药的现象。

1.2MBLs

MBLs的氨基酸序列具有多样性，但也具有一些共同功能特性，可水解除单酰胺环类药物如氨曲南外的所有抗菌药物[10]，其活性不被克拉维酸、舒巴坦及他唑巴坦所抑制，但活性位点锌离子能被乙二胺四乙酸抑制。按照蛋白质结构的不同及其水解底物的不同，可将其分为B1、B2和B3三个亚类，B1亚类包括IMP型MBLs(耐亚胺培南假单胞菌产金属酶)、VIM型MBLs(Verona整合子编码的金属酶)、NDM酶(新德里MBLs)、SIM酶家族。B1和B3亚类可水解广泛的β内酰胺类抗菌药物，B2亚类只水解碳青霉烯类抗菌药物[11]。

VIM型MBLs主要由铜绿假单胞菌产生，大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌也可产生，以VIM-2最常见，编码基因位于细菌的染色体或者质粒上，并以基因盒的形式存在于整合子中[12]。一般情况下，整合子位于质粒上或者以自身作为部分转座子参与耐药基因的转移。整合子是由5'-端和3'-端保守序列及二者间的可变区域构成，其可变区域中含有一个甚至多个耐药基因盒[13]。与革兰阴性杆菌耐药基因水平转移关系十分密切的是细菌的可移动元件，其中，耐药基因水平转移能力最为突出的是整合子。整合子位点通过特异性的重组捕获外源性基因盒，从而获取耐药基因，并在整合酶催化作用下使其表达，随整合子在不同的细菌之间动态传播[14]。

NDM酶主要存在于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中。产NDM酶的细菌也具有多重耐药或广泛耐药的现象。NDM酶目前有17种亚型，以NDM-1型最为常见。在肠杆菌科中，blaNDM可由大小不同的质粒所携带并在不同的细菌中进行传播。在肺炎克雷伯菌中，介导blaNDM基因传播的质粒类型主要为IncA/C。在鲍曼不动杆菌中，转座子Tn125携带着blaNDM基因。有研究表明blaNDM基因可以随着转座子Tn125在不同的宿主间及宿主内进行传播[15]。IMP型MBLs在铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌及鲍曼不动杆菌中都有产生，目前已发现48种IMP变体[16]。和其他碳青霉烯酶一样，IMP也是作为基因盒被整合在位于可水平转移的转座子和接合质粒的整合子上。

1.3D类碳青霉烯酶

在鲍曼不动杆菌中最常见的碳青霉烯酶为D类碳青霉烯酶，且以D类碳青霉烯酶中的奥沙西林水解碳青霉烯酶(OXA酶)为主[17]。在肠杆菌科及非发酵菌中广泛存在的也是具超广谱酶活性的OXA酶，而鲍曼不动杆菌中广泛存在的是具碳青霉烯酶活性的OXA酶。截至目前，将OXA酶按照其氨基酸序列的同源性分为9组，每个亚组内的氨基酸序列同源性≥92.5%，每个亚组间的氨基酸序列同源性为40%～70%[18]。我国以OXA-23型为主，其水解碳青霉烯类抗菌药物的活性更强。

2、膜孔蛋白的数量减少或者缺失

膜孔蛋白对细菌耐药性的产生有着十分重要的作用，其数量的减少或者缺失都会对抗菌药物进入细菌产生一定的影响。革兰阴性杆菌的外膜蛋白是一种非特异性跨膜蛋白，能让抗菌药物分子进入细菌内，但是当细菌频繁接触抗菌药物后，细菌的菌体就会发生突变，使外膜孔蛋白的表达量减少或不表达，最终导致进入菌体内的有效药量减少[19,20]。外膜蛋白的表达量下降、类型改变及蛋白通道开关的基因突变、中央通道的突变等都会使进入细菌体内的抗菌药物减少，而针对不同的抗菌药物，不同的外膜孔蛋白则发挥特异性作用，从而导致耐药性的产生。

铜绿假单胞菌的细胞壁有两层膜，外膜上分布OprC、OprD、OprE等具有孔道活性的蛋白[21]。OprD是一种狭窄特异性孔道蛋白，只能允许碳青霉烯类抗菌药物通过，而其他β内酰胺类药物无法通过该通道进入菌体内[22]。OprD基因突变、缺失以及碱基插入或者表达的减少都有可能致使OprD蛋白的减少或者缺失，从而使亚胺培南无法进入菌体，最终导致铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的发生。OprD基因突变导致铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药常见的形式有3种:(1)11bpDNA小片段的缺失(编码区395～405位)，使移码突变和形成提前新终止密码子，导致OprD2肽链异常;(2)1204bpDNA大片段缺失(启动子上游519位至编码区685位)，不能转录mRNA，导致OprD2蛋白缺失;(3)插入序列插入OprD2基因中，引起OprD2蛋白缺失[23]。OprD2的表达量减少和缺失会导致铜绿假单胞菌对亚胺培南产生耐药性，但对其他碳青霉烯类抗菌药物的影响较小，但当合并MexAB-OprM过表达时，也会表现出对喹诺酮类及其他β内酰胺类药物的耐药性[24]。

在鲍曼不动杆菌中，与碳青霉烯类药物有关的特异性膜孔蛋白是CarO,CarO的减少导致菌株对亚胺培南的敏感性降低。与大肠埃希菌有关的膜孔蛋白主要有OmpF、OmpC和PhoE。OmpF和OmpC偏向于微小的阳离子通过，而PhoE偏向于阴离子通过。在大肠埃希菌中，往往是染色体携带的AmpC基因过度表达AmpC酶和OmpC孔蛋白或者OmpF孔蛋白的改变共同产生耐药性[25]。膜孔蛋白的缺失只能降低菌体对碳青霉烯类药物的敏感性，要表达出高水平耐药则需要合并高产AmpC酶和超广谱β内酰胺酶等其他耐药机制。

3、外排泵的高表达

细菌外排泵的作用是将菌体内的药物泵出到菌体外，使菌体内的有效药物浓度降低，进而产生或增强耐药性。根据氨基酸序列同源性和底物特异性可将目前已知的外排泵系统分为主动外排系统ATP结合盒超家族(ABC)、小多重耐药家族、主要易化子超家族(MFS)、多药及毒性化合物外排家族、耐药节结化细胞分化家族(RND)[26]。细菌外排泵系统是由不同的蛋白质组成，包括内膜蛋白，中间连接蛋白及外膜蛋白。在这些外排泵中，除ABC超家族需依靠ATP水解提供能量外，其余外排泵家族都是由质子的转运形成H+浓度差产生势能来提供能量的。

不同的细菌有不同的外排系统起到主要作用。与大肠埃希菌耐药性有关的外排泵主要为:RND家族、ABC超家族及MFS超家族。其中对碳青霉烯类药物产生耐药性的是RND家族，其转运蛋白AcrB与融合蛋白AcrA以及孔道蛋白T01C共同构成转运系统AcrAB-T01C。有研究结果显示，envZ基因、AcrAB-T01C及青霉素结合蛋白(PBPs)基因的联合突变大大提高了大肠杆菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药性[27]。细菌外排泵AcrAB-TolC高表达同时伴随着OmpK35和OmpK36孔蛋白的缺失都与碳青霉烯类药物耐药有关。目前，与铜绿假单胞菌相关的至少有12个RND家族外排泵，其中，MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN和MexXY-OprM与碳青霉烯类药物耐药有关[28]。

MexAB-OprM外排泵是RND家族中最早被发现的，MexR、nalB、nalD3个基因能够调控其表达，且均为负性调节。其中MexR基因位于该外排泵的上游274个碱基处，通过编码其阻遏因子，能够与MexR和MexA之间的区域结合，抑制该外排泵的启动子，使该外排泵基因表达降低，而当MexR基因发生突变时，会引起MexAB-OprM外排泵表达作用增强。TetR家族抑制子是nalB，它的突变体中MexR结合位点的改变可导致该外排泵基因的高表达;而nalD则编码了类似TetR家族抑制子的蛋白，可以与MexAB-OprM上游的启动子结合，nalD的突变可导致该外排泵基因的过表达[29]。MexCD-OprJ受nfxB基因的负调节，编码的阻遏蛋白能够与MexC基因的上游结合。MexCD-OprJ大多数情况下不表达，但是β内酰胺类药物能够诱导其表达。如果nfxB发生突变，可能会导致MexCD-OprJ的高表达，进而使铜绿假单胞菌对碳青霉烯药物产生耐药性。MexXY-OprM基因的过表达也是引起铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药的原因。

细菌外排泵对细菌耐药性的产生有十分重要的影响，外排泵依靠质子的转运提供能量。外排泵基因可以由长期的底物诱导被激活，从而呈现出高表达状态，有研究报道当碳青霉烯类抗菌药物的外排速度超过抗菌药物进入到细菌体内的速度时，该细菌表现为耐药，反之则表现为敏感[30]。

4、PBPs的改变

PBPs位于细菌细胞内膜上，具有催化作用，是β内酰胺类药物的作用靶位[31]。PBPs是细菌在生长繁殖过程中必不可缺的酶。在细菌合成细胞壁肽聚糖的过程中，PBPs的主要作用是发挥糖基转移酶、肽基转移酶及D-丙氨酰-D丙氨酸羧肽酶活性。有研究通过对比多序列及分析结构数据证实了PBPs与β内酰胺酶的亲缘性，表明PBPs与β内酰胺酶的相似性很高。PBPs结构的改变或者数量的增多减少及与β内酰胺类抗菌药物的亲和力降低都会导致细菌产生耐药性[32]。根据与细菌的生理功能可将PBPs分为细菌生长必需蛋白、细菌生长非必需蛋白。例如:在金黄色葡萄球菌中，其PBP1、PBP2、PBP3、PBP4为其生长必需蛋白。而PBP2a是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌特有的蛋白质，为其生长非必需蛋白[33]。在大肠埃希菌中，高分子量PBPs在菌体生存过程中是必需的，因此称为细菌生长必需PBPs;而去除低分子量PBPs后，菌体依然能继续存活，因此称为细菌生长非必需PBPs[34]。PBPs的数量或者结构的变化会直接影响抗菌药物的杀菌效果。

大肠埃希菌中PBPs包括8种，分别为PBP1、PBP2、PBP3、PBP4、PBP5、PBP6、PBP7、PBP8，其功能各有不同。PBP1主要存在于细胞内膜，与抗菌药物结合可以导致菌体快速溶解，可分为PBP1a和PBP1b,PBP1b的缺失会损害大肠埃希菌的生物膜形成及其运动性，PBP1a及PBP1b都与细菌的生长有关，青霉素、氨苄西林等与它们有高度的亲和力，会使细菌生长繁殖受到抑制，导致细菌死亡[35]。PBP2和PBP3这2种青霉素结合蛋白的结构发生改变则会引起大肠埃希菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药性[36]。PBP2的作用是维持大肠埃希菌的张力，使之保持其杆棒状结构，美西林、亚胺培南及克拉维酸与PBP2能选择性的结合，结合后会导致PBP2的减少或者缺失，此时细菌细胞会形成圆球体，经几代繁殖后会溶解死亡。PBP3与细菌的分裂有关，PBP3在DNA复制完成后被激活并且催化羧激酶反应，产生肽聚糖合成反应。PBP3含量比较少，抗菌药物作用于PBP3后能阻止大肠埃希菌的分裂，使细胞形成丝状体而不溶解。PBP4具有D,D-羧肽酶和D,D-内肽酶活性，缺乏PBP4的菌株仍然可以存活证明PBP4并非β内酰胺类抗菌药物的主要作用靶位[37]。PBP5的羧基末端具有稳定蛋白质的作用，缺乏PBP5的菌株对某些抗菌药物特别敏感[38]。PBP6的作用是在静止期稳定肽聚糖结构，其静止期的含量要远远高于指数生长期。PBP8是PBP7的降解产物，它们都具有D,D-内肽酶的活性，能够特异性地分解一些细胞壁质的D,D-DAP-Ala间的肽键。

有研究指出，铜绿假单胞菌对碳青霉烯类耐药的主要原因是PBP2和PBP3表达量降低导致的[39],PBP2和PBP3也是细菌生存繁殖和保持正常形态必需的，编码PBP2的基因pbpA插入突变体对多种β内酰胺类抗菌药物的最低抑菌浓度明显降低，原因可能是PBP2缺失引起细菌的生存能力下降导致的。

细菌肽聚糖合成的过程中主要的酶类是PBPs，在不同的细菌中，PBPs的种类、数量、功能以及结构也有差异，但是各种PBPs对于细菌细胞壁的合成都起着关键的作用。PBPs的改变导致临床抗感染治疗的失败已日益严重，因此，针对PBPs的结构功能及耐药性做进一步深入研究对临床抗感染治疗意义重大。

5、总结与展望

在多种致病耐药菌中，革兰阴性杆菌多重耐药性的发生率高[40,41]，其耐药机制主要与超广谱β内酰胺酶的异常产生有关。目前，碳青霉烯类抗菌药物仍是治疗由革兰阴性杆菌引起的多重耐药的首选药物。然而，由于临床对于碳青霉烯类药物的过度依赖和不合理的应用，耐碳青霉烯类革兰阴性杆菌已经在世界范围内出现，并加剧传播。

革兰阴性杆菌可通过多种机制对碳青霉烯类药物产生耐药性，碳青霉烯酶的产生是其最突出的特征之一，能够水解碳青霉烯类药物，从而导致耐药性的发生。除了合理的控制碳青霉烯类药物的临床应用，还可以通过开发出更稳定的碳青霉烯类药物或者联合使用相应的酶抑制剂从而减少耐药性事件发生。此外，细菌外膜蛋白数量的改变导致菌体的突变、外排泵的高表达及PBPs的改变也是细菌耐药性逐渐上升的重要原因。随着对细菌外排泵系统更加深入的研究，开发可用于临床的外排泵抑制剂，或者通过基因沉默、抗体甚至噬菌体抑制泵来干扰外排泵的表达[42]，可以降低碳青霉烯类抗菌药物的耐药率。研究耐碳青霉烯类革兰阴性杆菌的耐药机制，并根据相应的分子机制制定科学合理的诊疗方案，这对于解决抗菌药物耐药性问题具有重要意义。

当前形势下，严格控制抗菌药物的使用，加强细菌耐药监测已成为延缓抗菌药物耐药蔓延的有力措施。各个医院需要加强控制院内感染，指导患者合理使用抗菌药物，以尽可能的防止多重耐药性细菌的出现。目前药物学家对抗菌药物的耐药性研究取得了显著进展，但是从长远来看，对耐碳青霉烯类革兰阴性杆菌的耐药机制进行进一步的探索，针对特定的耐药机制研发新型的抗菌药物或能够改善革兰阴性杆菌对碳青霉烯类药物耐药性的联合治疗药物迫在眉睫。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

文章来源：孙磊,张敏敏,冀凯,张荻,丁艳娇,明颢.革兰阴性杆菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药机制及研究进展[J].中国医药,2021,16(09):1415-1419.