首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 医学职称论文 > 医学职称论文范文 > 艾灸对帕金森病模型大鼠黑质纹状体系统氧化应激损伤的影响及作用机制

艾灸对帕金森病模型大鼠黑质纹状体系统氧化应激损伤的影响及作用机制

2020-08-11 272 上传者：管理员

摘要：目的：基于转录因子NF-E2相关因子-2(Nrf2)/抗氧化反应元件（ARE）通路探讨艾灸对帕金森病（PD）模型大鼠黑质纹状体系统氧化应激损伤的影响及作用机制。方法：将48只SD大鼠随机分为空白组、假手术组、模型组、艾灸组，每组12只。模型组、艾灸组大鼠采用6-羟多巴胺（6-OHDA）单侧两点注入法制备PD模型；假手术组大鼠手术操作同模型组及艾灸组，单侧两点注入等体积的0.9%氯化钠溶液。艾灸组大鼠予艾灸“百会”“四神聪”干预，每次20min，每天1次，每周6d，共干预6周。其余3组大鼠不予任何干预。HE染色法观察各组大鼠右侧中脑黑质形态，免疫组化法检测各组大鼠右侧中脑黑质酪氨酸羟化酶（TH）表达，比色法检测各组大鼠纹状体活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）表达，Westernblot法检测各组大鼠纹状体转录因子NF-E2相关因子-2(Nrf2)、血红素氧合酶-1(HO-1)蛋白表达。结果：空白组及假手术组大鼠右侧中脑黑质组织结构清晰、多巴胺能神经元形态完整；模型组大鼠组织结构混乱，神经元减少、胞体肿胀；艾灸组大鼠神经元较模型组增多、水肿减轻。与假手术组比较，模型组大鼠右侧中脑黑质TH表达降低（P<0.01）；与模型组比较，艾灸组大鼠右侧中脑黑质TH表达升高（P<0.05）。与假手术组比较，模型组大鼠纹状体ROS、MDA表达升高（P<0.01）,GSH、GSH-Px、Nrf2及HO-1表达降低（P<0.05,P<0.01）；与模型组比较，艾灸组ROS、MDA表达降低（P<0.05,P<0.01）,GSH、GSH-Px、Nrf2及HO-1表达升高（P<0.05,P<0.01）。结论：艾灸可通过激活Nrf2/ARE通路减轻PD大鼠黑质纹状体系统氧化应激损伤，从而发挥对多巴胺能神经元的保护作用。

关键词：
Nrf2/ARE信号通路
多巴胺能神经元
帕金森病
氧化应激
艾灸
加入收藏

帕金森病（PD）又称震颤麻痹，是一种多发于中老年人的神经系统退行性疾病，典型的病理表现为黑质纹状体系统多巴胺能神经元变性缺失以及路易小体（LB）的形成[1]。PD具有高致残率和高发病率的特点，目前缺乏有效的治疗药物，给社会和患者家庭带来沉重负担[2]。PD发病的机制尚不明确，研究[3,4]表明氧化应激反应的增强在PD患者黑质多巴胺能神经元死亡过程中起重要作用。黑质中活性氧（ROS）大量聚集可导致多巴胺能神经元受损，从而引起一系列运动障碍症状[5,6]。因此，抗氧化应激损伤是目前保护脑内多巴胺能神经元的重要研究方向。转录因子NF-E2相关因子-2(Nrf2）是抗氧化反应的主要调节因子，诱导体内多种内源性抗氧化酶表达，其中血红素氧合酶-1(HO-1）是Nrf2/抗氧化反应元件（ARE）信号通路的主要内源性保护基因[7,8]。激活Nrf2/ARE信号通路、上调抗氧化酶表达，可提高神经细胞对氧化应激的抵抗能力，有效保护脑组织[9,10]。

Meta分析[11]表明艾灸能有效改善PD患者运动功能，但艾灸是否能通过激活Nrf2/ARE信号通路减轻氧化损伤，从而对神经起到保护作用，目前尚不清楚。故本研究采用6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine,6-OHDA）单侧两点注入法制备PD模型，探讨艾灸“百会”“四神聪”对PD模型大鼠神经保护作用及其可能作用机制。

1、材料与方法

1.1实验动物与分组

SPF级8周龄雄性SD大鼠48只，体质量180～220g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司[动物许可证号：SCXK（京）2014-0004]。饲养于宝安中医院动物中心，温度22～26℃，相对湿度60%～70%，自由饮食、饮水。大鼠适应性饲养7d后，随机分为空白组、假手术组、模型组及艾灸组，每组12只。实验过程中对动物的处置符合科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2主要试剂及仪器

水合氯醛粉末（20171215，大茂化学试剂厂），6-OHDA(066M46002V，美国Sigma），阿扑吗啡（WDM6912，日本Wako），抗坏血酸（rxx10，美国BioRuler),ROS试剂盒（BB19031，上海贝博生物科技有限公司），丙二醛（MDA）试剂盒（20170509，南京建成生物工程研究所），谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒（20190218，南京建成生物工程研究所），多聚甲醛（M48418030，上海麦克林生化科技有限公司），冰醋酸（20140901-2，广州化学试剂厂），BCA蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），RIPA裂解液（上海碧云天生物技术有限公司），显影液（P90719，美国Millipore），免疫组化染色试剂盒（13C23C，博士德生物），酪氨酸羟化酶（TH）抗体（AB152，美国Millipore),Nrf2抗体（ab31163,abcam),HO-1抗体（ab13248,abcam),GAPDH抗体（sc-32233,SantaCruz），山羊抗兔抗体（E03012001,EARTH），山羊抗鼠抗体（E03011001,EARTH）。

艾艾贴（深圳前海生物科技有限公司），大鼠脑立体定位仪（中国瑞沃德公司），颅骨钻（中国瑞沃德公司），光学显微镜（日本OLYMPUS），全自动石蜡切片机（德国LEICA），电子天平（德国Sartorius),5μL微量进样器（中国精创医疗器械有限公司），多功能酶标仪（美国Biotek），化学发光凝胶成像仪（美国ProteinSimple）。

1.3模型制备

模型组、艾灸组大鼠腹腔注射10%水合氯醛（4mL/kg）麻醉后，于脑立体定位仪颅平位固定，备皮消毒后沿正中线切开颅顶皮肤，剥离骨膜，暴露前囟。根据《大鼠脑立体定位图谱》[12]确定右侧黑质位置：前囟后4.8mm、正中线右1.9mm、硬膜下7.5mm；中脑腹侧被盖区：前囟后4.8mm、正中线右1.1mm、硬膜下8mm。用颅骨钻钻透颅骨，两点各注射6-OHDA16μg（浓度4mg/mL，溶剂为含0.2%抗坏血酸的0.9%氯化钠溶液），注射速度为0.5μL/min，留针10min，然后以1mm/min速度缓慢退针。无菌缝合，连续7d腹腔注射8万U青霉素抗感染。造模4周后，腹腔注射阿扑吗啡（0.5mg/kg）诱发大鼠向健侧旋转，记录从开始旋转至1h内的旋转圈数，以旋转圈数≥7次/min为PD模型复制成功。

假手术组采用相同方法麻醉、开颅、打孔，两点分别注射等体积的0.9%氯化钠溶液（含0.2%抗坏血酸）。

1.4干预方法

艾灸组大鼠予艾灸“百会”“四神聪”干预，穴位定位参照文献[13,14]。于每日相同时间点进行干预，点燃艾条距穴位约1cm处悬灸，每次20min，每天1次，每周6d，共干预6周。其余3组大鼠不予任何干预。

1.5指标检测

艾灸干预结束后次日，每组随机抽取6只大鼠，断头取脑，在冰上迅速分离出纹状体，置于-80℃冰箱保存。每组剩余6只大鼠用10%水合氯醛（4mL/kg）麻醉，经左心室4%多聚甲醛缓冲液灌注固定后，取脑组织并分离右侧中脑，置于4%多聚甲醛中浸泡固定。

(1)HE染色法观察各组大鼠右侧中脑黑质形态：将固定于4%多聚甲醛的中脑组织取出脱水后，常规石蜡包埋后切片，厚度为4μm，每只切3片。切片常规脱蜡，先后采用苏木素和伊红染料进行染色，脱水后用中性树脂封片，在400倍光学显微镜下观察病理组织变化并采集图像结果。

(2）免疫组化法检测各组大鼠右侧中脑黑质TH表达：70℃烤片1.5h，脱蜡后高压热修复抗原。PBS洗，加3%过氧化氢溶液孵育10min,PBS洗，滴加5%BSA室温封闭1h，加小鼠抗TH单克隆抗体（1∶1000),4℃过夜。PBS洗，加HRP标记的第二抗体（1∶1000），室温下孵育1h。PBS洗，加DAB显色液，400倍光学显微镜下观察，出现阳性反应后蒸馏水终止显色。水冲洗，苏木素复染，PBS冲洗返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。使用IPP6.0软件对免疫组化照片进行吸光度分析，每组取3张病理切片检测平均吸光度值（AOD）列入统计。

(3）比色法检测各组大鼠纹状体ROS、MDA、GSH及GSH-Px表达：取冰冻的纹状体组织，按照质量（g）∶体积（mL)=1∶9的比例加入0.9%氯化钠溶液冰水浴匀浆，3000r/min、4℃离心10min，取上清液。按试剂盒说明书，经混匀、水浴及显色反应等步骤后，使用多功能酶标仪检测吸光度值（OD），计算得出ROS、MDA、GSH及GSH-Px的表达情况。

(4)Westernblot法检测Nrf2、HO-1蛋白表达：取冰冻的纹状体组织，液氮中研碎后置于组织裂解液中裂解，4℃、12000r/min离心15min，取上清，采用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度，每孔上样30μg蛋白。制备聚丙烯酰胺凝胶进行电泳（SDS-PAGE），浓缩胶（5%)80V、30～40min，分离胶（8%,10%)120V、60～70min。电泳后将蛋白转至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，牛血清白蛋白封存60min,4℃一抗封闭过夜（Nrf2抗体，1∶500;HO-1,1∶250;GAPDH,1∶1000）。TBST洗膜，加入二抗（山羊抗兔抗体，1∶5000；山羊抗鼠抗体，1∶5000），常温孵育60min,TBST漂洗，化学发光凝胶成像仪显影，并用AlphaViewSA3.4.0分析目的条带灰度值。

1.6统计学处理

采用SPSS20.0软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1各组大鼠右侧中脑黑质形态比较

空白组和假手术组大鼠右侧中脑黑质组织结构清晰，神经元形态完整、数量较多，细胞核清晰；模型组大鼠右侧中脑黑质组织结构混乱，多巴胺能神经元减少、胞体肿胀；艾灸组大鼠右侧中脑黑质组织神经元较模型组增多、水肿减轻。见图1。

2.2各组大鼠右侧中脑黑质TH阳性表达比较

假手术组与空白组比较右侧中脑黑质TH阳性表达差异无统计学意义（P>0.05）；与假手术组比较，模型组大鼠右侧中脑黑质TH阳性表达降低（P<0.01）；与模型组比较，艾灸组大鼠右侧中脑黑质TH阳性表达升高（P<0.05）。见图2。

图1各组大鼠右侧中脑黑质神经元形态

图2各组大鼠右侧中脑黑质TH表达比较

2.3各组大鼠纹状体ROS、MDA、GSH及GSH-Px表达比较

假手术组与空白组比较，大鼠纹状体ROS、MDA、GSH及GSH-Px表达差异无统计学意义（P>0.05）；与假手术组比较，模型组大鼠纹状体ROS、MDA表达升高（P<0.01),GSH、GSH-Px表达降低（P<0.01）；与模型组比较，艾灸组大鼠纹状体ROS、MDA表达降低（P<0.05,P<0.01),GSH及GSH-Px表达升高（P<0.05）。见图3。

2.4各组大鼠纹状体Nrf2、HO-1蛋白表达比较

假手术组与空白组比较，大鼠纹状体Nrf2、HO-1蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）；与假手术组比较，模型组大鼠纹状体Nrf2和HO-1蛋白表达下降（P<0.05,P<0.01）；与模型组比较，艾灸组大鼠纹状体Nrf2和HO-1蛋白表达增加（P<0.05）。见图4。

3、讨论

帕金森病（PD）属中医“颤证”范畴，病位在脑，病机为髓海失充以致脏腑渐衰、筋脉失养，证型多为肝肾不足、气血亏虚、痰热动风、血瘀动风[15,16]。督脉“上入络脑”，可直接调节脑部功能。百会位居头顶，属督脉，是肝经与督脉交会之所，具有通督醒脑、息风止颤之效。四神聪为经外奇穴，居于巅顶，与百会合用，可调节全身的经气，具有安神益智、健脑调神之功效。

图3各组大鼠纹状体ROS、MDA、GSH及GSH-Px表达比较

图4各组大鼠纹状体Nrf2、HO-1蛋白表达比较

TH是脑内多巴胺合成的限速酶，常用作多巴胺能神经元的特异性标志蛋白，其在脑内的含量变化能够间接反映多巴胺能神经元的活性。本实验结果显示，假手术组与空白组大鼠右侧中脑黑质TH阳性表达差异无统计学意义，模型组右侧中脑黑质TH阳性表达明显减少，病理改变明显；艾灸干预后，艾灸组大鼠TH阳性表达较模型组增多，神经元形态较为正常，提示艾灸“百会”“四神聪”可通过增加PD大鼠中脑TH阳性表达，修复黑质纹状体系统神经元损伤，发挥对多巴胺能神经元的保护作用。

ROS是正常生物代谢产物，而过量ROS累积可导致氧化性脱氧核糖核酸（DNA）损伤，蛋白酶失活和脂质过氧化[17]。研究[18,19,20]发现，PD患者脑组织处于氧化应激状态，氧化应激过度和ROS所致损伤可能是PD发病中的重要一环。MDA是脂质过氧化的最终产物，其水平变化可间接反映ROS水平变化和组织氧化受损程度[21]。GSH-Px是机体内重要的抗氧化应激酶，可特异性催化GSH对过氧化氢的还原反应，从而维持体内ROS的动态平衡[22]。本实验结果表明，艾灸“百会”“四神聪”能够降低PD模型大鼠纹状体ROS及MDA水平，提高GSH-Px活力和GSH含量，提示艾灸可提高机体清除ROS的能力，改善黑质纹状体系统的氧化应激状态，通过调节氧化应激途径治疗PD。

Nrf2是调节机体抗氧化应激反应的重要转录因子，在受到外界刺激时，Nrf2易位至细胞核与抗氧化反应元件（ARE）结合，激活ARE调节的一系列抗氧化酶的基因表达，增强细胞对氧化应激的抗性[23]。HO-1是Nrf2/ARE信号通路激活后产生的重要内源性保护物质，可以降低机体暴露于强氧化应激反应所致的神经元损伤[24,25]。本实验结果显示，艾灸组大鼠纹状体Nrf2及HO-1蛋白表达较模型组升高，提示艾灸可有效激活Nrf2/ARE信号通路，增加其下游因子HO-1蛋白表达，以此对抗氧化应激损伤，保护脑内多巴胺能神经元。

综上所述，艾灸“百会”“四神聪”可有效保护黑质纹状体系统多巴胺能神经元，这种保护作用可能是通过Nrf2/ARE信号通路，改善PD大鼠脑内氧化应激反应实现的。本研究为临床应用艾灸治疗PD提供了一定的实验依据和理论基础，促进艾灸治疗PD在临床上的应用。

参考文献：

[1]李大年.现代神经内科学[M].济南:山东科学技术出版社,2002.

[2]刘疏影,陈彪.帕金森病流行现状[J].中国现代神经疾病杂志,2016,16(2):98-101.

[11]张雪淳,蒋丽,伍亚男,等.基于Meta分析的艾灸治疗帕金森病疗效研究[J].亚太传统医药,2016,12(14):96-100.

[12]包新民,舒斯云.大鼠脑立体定位图谱[M].北京:人民卫生出版社,1991:53.

[13]郑利岩,张小卿,王熙,等.实验大鼠常用经穴检测与定位[J].辽宁中医杂志,2010,37(10):2058-2060.

[14]郭义.实验针灸学[M].北京:中国中医药出版社,2008.

[15]李静,王丽娜,肖红玲,等.电针对帕金森病大鼠中脑黑质多巴胺能神经元氧化应激损伤的影响[J].针刺研究,2014,39(3):185-191.

[16]董珺,崔花顺.秦氏“头八针”为主针刺治疗帕金森病[J].中国针灸,2014,34(5):491-494.

柳雪蕾,芦娟,田叶,张贵育,赵彩萍,王婷婷,李欣蓉,朱美玲.艾灸激活Nrf2/ARE通路抗帕金森病模型大鼠氧化应激损伤的机制研究[J].中国针灸,2020,40(08):857-862.

基金:国家自然科学基金资助项目:81673770;深圳市科技创新委员会基金资助项目:JCYJ20150401161033959