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重组人抗缪勒管激素C-末端蛋白的原核表达水平及纯化

2020-08-12 568 上传者：管理员

摘要：目的：原核表达重组人抗缪勒管激素C-末端蛋白，并进行纯化。方法：PCR法扩增hAMHC-末端蛋白基因，插入至载体pET-28a，构建重组表达质粒pET-28a-hAMHC。重组质粒转化感受态E.coliBL21(DE3），终浓度为1.0mmol/L的IPTG诱导表达hAMHC-末端蛋白。扩大培养后进行Ni亲和层析柱纯化，12%SDS-PAGE分析纯化产物。结果：经菌落PCR及测序鉴定，重组质粒pET-28a-hAMHC构建正确。表达及纯化产物均可见相对分子质量约12500的目的蛋白条带，纯度达90%以上。结论：原核表达了重组hAMHC-末端蛋白，纯化后获得了较高纯度的目的蛋白。

关键词：
人抗缪勒管激素
原核表达
基因重组
融合蛋白
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抗缪勒管激素又称缪勒管抑制物，在胚胎的性别分化中起着非常重要作用，参与早期性器官定向分化[1]。AMH于男性胎儿8周时开始表达，由睾丸曲精小管的支持细胞生成，诱导男性缪勒管退化，而乌尔夫管则发育成男性生殖系统，出生后AMH可调节男性睾丸间质细胞的功能[2]。AMH于女性胎儿36周表达，促使缪勒管发育成子宫、输卵管和阴道的上部分[3]。女性AMH主要由卵巢颗粒细胞生成，其作用是通过减少卵泡刺激素对窦前和小窦状卵泡的刺激，抑制始基卵泡的募集和窦卵泡的发育，从而防止卵泡过早耗竭，参与卵泡的规律生成[4,5]。AMH的浓度能准确反映卵巢的储备功能，可诊断卵巢早衰、用于辅助生殖技术对患者制定个体化促排卵方案、诊断多囊卵巢综合症、指导卵巢颗粒细胞瘤的诊疗[6]、作为其他疾病治疗过程中的女性卵巢储备功能及生育能力的评估依据[7]等。

AMH是一种相对分子质量为140000的糖蛋白，糖含量为13.46%，属于转化生长因子β超家族，位于19号染色体短臂（19pl13.3），由含5个外显子的275对碱基组成[2]。AMH是由含560个氨基酸的AMH前体（proAMH）除去24个氨基酸片段后，分子糖基化，形成两个相对分子质量为70000的亚基，通过硫化物连接而成[6]。ProAMH蛋白水解形成可变区N-末端（AMHN，相对分子质量115000）和成熟区C-末端结构域（相对分子质量25000，由两个相对分子质量为12500单体组成的二聚体），C-末端片段与N-末端片段结合才具有与AMH受体结合的活性[8]。AMH受体Ⅰ（AMHreceptorⅠ，AMHRⅠ）和AMHRⅡ存在于间叶细胞[9],AMH与AMHRⅡ结合，启动与AMHRⅠ的结合，形成二聚体AMH复合物，诱导AMHRⅠ酪氨酸磷酸化，导致Smad蛋白复合体进入细胞核参与基因翻译[10]。本研究采用E.coli系统表达人AMH(hAMH)C-末端蛋白，并进行Ni亲和层柱纯化，以期获得高纯度重组蛋白，为后续研究AMH对卵巢癌细胞凋亡的影响奠定基础。

1、材料与方法

1.1质粒、菌株及细胞

载体pET-28a（+）购自美国EMDBiosciences(Novagen）公司；感受态E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3）由汕头大学微生物与免疫学实验室保存；SKOV3细胞购自湖南丰晖生物科技有限公司。

1.2主要试剂及仪器

质粒DNA提取试剂盒、核糖核酸酶A(RNaseA）及胶回收试剂盒购自上海碧云天生物技术公司；限制性内切酶、dNTPMixture、DNAmarkerDL2000、10×PCRbuffer、TapDNA聚合酶、T4DNA连接酶、Trizol试剂及逆转录试剂盒均购自日本TaKaRa公司；三氯甲烷（氯仿）及异丙醇购自郑州震峰化工产品有限公司；蛋白胨购自德国Merck公司；琼脂糖购自西班牙Biowest公司；酵母提取物购自英国OXOID公司；分析纯CaCl2购自郑州富利来化工公司；无菌甘油购自四川科伦药业股份有限公司；蛋白质marker购自生工生物工程（上海）股份有限公司；卡那霉素及IPTG购自美国Sigma公司；Ni亲和纯化柱购自北京韦氏博慧色谱科技有限公司。

1.3细胞培养

采用LB培养基，于37℃培养SKOV3细胞，取对数生长期细胞用于后续试验。

1.4目的基因的扩增

根据GenBank中登录的hAMH基因序列（268），应用PrimerPremier软件设计引物，Forward:5′-CGCGGATCCAGCGCGGGGGCCA-CCGCCGC-3′，Reverse:5′-CCGGAATTCTTACCGGCAG-CCACACTCGGTG-3′，扩增产物大小为327bp。引物由日本TaKaRa公司合成。用Trizo试剂提取SKOV3细胞总RNA，逆转录为cDNA，以其为模板扩增C-末端蛋白基因。PCR反应条件为：95℃预变性3min;95℃变性40s,60℃退火40s,72℃延伸30s，共35个循环；72℃再延伸5min。PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.5重组质粒的构建

将胶回收PCR产物及载体pET-28a（+）分别经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后，以T4DNA连接酶于16℃连接2h；连接产物转化至感受态E.coliDH5α，涂布于LB培养基，于37℃培养12h；挑取7个重组菌落进行菌落PCR鉴定，将鉴定正确的质粒送深圳华大基因股份有限公司测序。将测序正确的重组质粒命名为pET-28a-hAMHC。

1.6重组蛋白诱导表达

将重组质粒pET-28a-hAMHC转化至感受态E.coliBL21，于37℃倒置培养过夜；筛选阳性克隆，按1∶30的比例接种于含卡那霉素（0.05μg/μL）的LB液体培养基，于37℃，180r/min振荡培养12h；当菌液A600=0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度1.0mmol/L,26℃诱导5h，菌液浓度调至A600=0.6～0.8时，诱导产物进行12%SDS-PAGE分析。

1.7扩大培养

取细菌悬液1mL，以1∶100的比例接种于100mL的LB液体培养基中，诱导表达条件同1.6项，进行扩大培养，于37℃，180r/min振荡培养1～2h,A600为0.7时停止培养。

1.8目的蛋白的纯化

将扩大培养的菌液经超声破碎后，取10份200mL菌液，分别缓慢加入等体积的5%～50%饱和硫酸铵溶液，同时搅拌，浓度达1∶1时，于4℃条件下搅拌0.5h，使蛋白充分沉淀；1000×g离心20min，弃上清。用10mLBufferA溶解沉淀，调节pH至7.9,0.45μm滤膜过滤。将Ni亲和层析柱用BufferA（含50mmol/LTris、150mmol/LNaCl）平衡10个体积，上样，BufferA淋洗10个柱床体积；用分别含20%、30%、40%、50%、60%的洗脱液B(200mmol/L咪唑）进行阶段洗脱，每个浓度洗脱5个柱床体积，收集各阶段洗脱液。上样及洗涤流速均为1mL/min。将纯化蛋白于4℃条件下用PBS溶液透析。各组分均进行12%SDS-PAGE分析。

2、结果

2.1目的基因PCR产物的鉴定

hAMHC-末端蛋白基因PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，可见327bp的目的基因条带，与理论值一致，见图1。

图1hAMHC-末端蛋白基因PCR产物电泳图

2.2重组质粒的鉴定

1、2、3、5、6、7号重组菌落的PCR产物于327bp处均可见清晰的目的基因条带，与理论值一致，见图2。测序结果表明，插入序列与AMHC-末端基因序列相符，未发生突变。表明重组质粒构建正确。

图2重组菌的菌落PCR鉴定

2.3重组蛋白的鉴定

重组蛋白的相对分子质量约12500，大小与理论值相符，且主要在裂解上清中表达，见图3。

图3表达产物的SDS-PAGE分析

2.4纯化产物的鉴定

纯化产物相对分子质量约12500，大小与理论分子量相符，见图4，纯度达90%以上。

图4纯化产物的SDS-PAGE分析

3、讨论

本研究成功构建了重组表达质粒pET-28ahAMHC，并采用E.coli原核表达系统进行了重组蛋白表达。与真核表达系统比较，原核表达系统具有产量高、周期短、易纯化、效率高、成本低的优点，是表达异源蛋白质的首选系统[11]。E.coliBL21是常见的用于蛋白表达的菌株，表达蛋白质后不会被溶解，且蛋白质翻译和折叠的速率比在真核细胞中高约10倍。因此本实验采用E.coliBL21(DE3）进行重组蛋白的表达。

另外，许多实验均是采用睾丸组织体外培养和色谱纯化法获得哺乳类动物的AMH蛋白[12,13]，但该方法步骤复杂，且得到的蛋白纯度较低，因此本实验将测序正确后重组质粒转化E.coliBL21(DE3）进行诱导表达hAMHC-末端蛋白，克服了原核表达易形成包涵体的缺点，在温度为26℃，诱导时间为5h,IPTG终浓度为1.0mmol/L条件下大量表达可溶性hAMHC-末端蛋白。分子伴侣共同表达及向培养基中加入双甘氨肽也是常用的促进蛋白可溶性表达的方法[14]，考虑可在后续实验进行深入研究。pET-28a（+）载体利用C2端带有的组氨酸有利于纯化与鉴定[15],E.coli表达系统在表达蛋白时存在过度表达的情况，易形成包涵体，导致功能异常及蛋白纯化困难。Ni亲和层析具有载量高、稳定性好、寿命长、使用方便、颗粒小而均匀分离效果好的优点。通过6×His标签与金属离子镍高亲和力结合的原理通过镍柱直接纯化，充分利用标签的性质纯化重组蛋白，纯度可高达98%，且纯化产物具有较高的生物学活性[16]。本实验采用Ni亲和层析纯化目的蛋白，纯度高达90%以上，可满足后续大多数实验要求。

综上所述，本实验采用E.coliBL21原核表达系统成功表达了可溶性重组hAMHC-末端蛋白，经Ni亲和层析纯化后，获得了较高纯度的重组蛋白。本研究为后续hAMH重组蛋白在卵巢癌细胞系中作用的研究奠定了基础。

参考文献：

[11]梁桂芳.IER5原核表达载体的构建及融合蛋白表达､纯化[D].河北石家庄:河北医科大学,2010.

[13]丁炜东,曹哲明,曹丽萍.罗非鱼AMH基因的原核表达及多克隆抗体制备[J].水产学报,2010,34(5):656-663.

[15]韩俊岭.Prdx6-11R融合蛋白的表达､纯化及功能的初步研究[D].宁夏银川:宁夏医科大学,2014.

[16]萨姆布鲁克J,拉塞尔DW,等.分子克隆实验指南[M].黄培堂,等.译.3版.北京:科学出版社,2002:1217,1270.

林丽淑,龙韵洪,徐丽惠,冯振通,谢陈莹,陈睿,王革非.重组人抗缪勒管激素C-末端蛋白的原核表达及纯化[J].中国生物制品学杂志,2020,33(08):890-893.