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分离自手足口病和疱疹性咽峡炎患者的柯萨奇病毒A组10型病毒的基因组差异及基因特征

2020-08-12 673 上传者：管理员

摘要：目的：比较2株分离自手足口病和疱疹性咽峡炎患者粪便样品中的柯萨奇病毒A组10型全基因组差异及基因特征，探讨基因突变可能导致的临床症状差异。方法：收集昆明市儿童医院经实时荧光定量PCR检测结果为CA10阳性的HFMD及HA患者粪便样品，在敏感细胞人横纹肌瘤细胞上培养并分离出CA10。设计特异性引物扩增获得CA10全基因序列，通过BioEdit软件比较分离自HFMD及HA患者的CA10基因序列核苷酸与编码氨基酸之间的差异。从NCBI基因库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中下载CA10VP1基因序列作为参考序列，系统进化树分析分离获得的昆明CA10流行株的进化情况及来源。结果：分离自HFMD和HA患者的CA10-HFMD和CA10-HA的VP1区域核苷酸同源性为99.1%，氨基酸同源性为99.8%，且存在2个非同义突变位点；全基因序列核苷酸同源性为98.9%，编码区氨基酸同源性为99.5%，且存在12个非同义突变位点。系统进化分析表明2个昆明CA10分离株均位于G基因谱系，且与KF999765（北京）和JX473455（深圳）株亲缘关系最近。结论：来源于HFMD和HA患者的CA10分离株在核苷酸和氨基酸水平上相似性较高，且属于同一基因谱系。基因突变导致的氨基酸变异可能影响病毒的毒力从而导致患者症状的差异。

关键词：
手足口病
柯萨奇病毒A组10型
疱疹性咽峡炎
进化分析
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手足口病是由多种肠道病毒引起的一种儿科传染病[1]。肠道病毒属于肠道病毒属，有100多种血清型，分为4大类：EV-A、EV-B、EV-C和EV-D[2]。肠道病毒71型（enteroviruses71,EV71）和柯萨奇病毒A16型（CoxsackievirusA16,CA16）是引起HFMD的主要循环病原体，在严重病例中以EV71型为主[3]。HFMD多发于5岁以下儿童，可导致各种临床症状，包括发烧、手、脚和臀部的皮疹、口腔水泡或溃疡[4]。HFMD已成为亚太地区的主要公共卫生威胁，其发病率和死亡率均极高。2017年，中国共发生HFMD1952435例[5]。

EV71和CA16是最流行的病毒血清型，占2008～2012年全国范围调查报告感染病例的70%以上[6]。然而，近年来随着流行的增加，柯萨奇病毒A6型（CA6）和柯萨奇病毒A10型（CA10）成为主要致病血清型[7,8,9]。CA10是肠道病毒A属的一种，已成为全球儿童HFMD和疱疹性咽峡炎的主要病因之一[10]。CA10具有高度传染性，每年影响数百万儿童。疫苗接种被认为是控制HFMD最有效的策略。尽管近期在开发疫苗[11,12]和治疗CA10感染[13,14]方面取得了一些进展，但仍无临床可用疫苗或有效疗法。本研究在分子水平对来源不同的CA10基因序列进行分析，初步探索CA10导致不同症状的可能原因。

1、材料与方法

1.1细胞

人横纹肌瘤细胞（rhabdomyoma,RD）购自中国医学科学院医学生物学研究所。

1.2主要试剂及仪器

病毒RNA提取试剂盒购自德国QIAGEN公司；逆转录试剂盒、PCRMIX购自日本TaKaRa公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；MEM培养基购自中国医学科学院医学生物学研究所；PCR仪购自新加坡ABI艺思高科技有限公司。

1.3样品来源及处理

粪便样品收集自2018年昆明市儿童医院荧光定量PCR检测CA10为阳性的HFMD及HA患者粪便样品。收集的粪便样品立即送实验室，挑取约2g于1.5mLEP管中，加入400μL含抗生素的无酚红PBS充分振荡溶解，4℃，800×g离心10min，收集澄清上清于新的1.5mLEP管（若上清相对较浑浊可转移后再离心1次），经0.22μm滤器过滤，并于-80℃储存。

1.4病毒培养及分离

RD细胞在T25培养瓶长成单层后，弃培养基上清，PBS洗涤3次，用1mL1%胰蛋白酶消化细胞，加入5%完全培养基（5%FBS+1%青霉素/链霉素+2%NaHCO3+2%谷氨酰胺+MEM），按1×105个/孔的细胞量加至6孔板。实验组加入200μL含病毒的粪便上清，对照组加入等量培养基，混匀后置37℃，5%CO2培养箱培养过夜；收集上清200μL，再次接种至铺满单层RD细胞的6孔板中，37℃，5%CO2培养箱培养48h；将培养板置-80℃2h以上，常温解冻，重复3次反复冻融后，将含有病毒的培养基经0.22μm滤器分装。

1.5病毒液的PCR鉴定

用病毒RNA提取试剂盒提取粪便上清病毒RNA（具体操作按试剂盒说明书进行），逆转录合成cDNA（具体操作按逆转录试剂盒说明书进行），以其为模板，利用CA10特异性引物（上游引物：5′-CACTTCTTCTCCCGCTCT-3′，下游引物：5′-GGTTGGCCCAGTCATTAT-3′，扩增片段大小为738bp；引物由北京擎科生物技术有限公司合成）进行PCR扩增。反应条件：98℃预变性2min;98℃30s,55℃30s,72℃1min，共35个循环；72℃最后延伸5min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，并送北京擎科生物技术有限公司进行双向测序，序列经BLAST比对分析。

1.6全基因序列的获得

选取同源性最高的KX595288（深圳）作为参考株，利用Primer5软件设计CA10全基因引物，引物序列见表1，引物由北京擎科生物技术有限公司合成。PCR扩增全基因产物，经1%琼脂糖凝胶电泳确认特异性目的条带，并送北京擎科生物技术有限公司进行双向测序，通过BioEdit软件拼接得到全基因序列。

表1CA10全基因组扩增引物的核苷酸序列

1.7HFMD和HA患者CA10基因特征分析

利用BioEdit比较2株CA10全基因和VP1序列核苷酸以及对应的编码区和VP1区域氨基酸同源性。同时比较分离株CA10与CA10原型株（AY421767）在核苷酸和氨基酸上的相似性。

1.8序列同源性和进化分析

将NCBI基因库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中下载的CA10VP1基因序列作为参考序列，与本次分离株CA10VP1基因序列进行同源性比较和进化分析。采用邻接法（NeighborJoiningtree）构建基于CA10VP1基因序列的进化树，选择Kimura2-Parameter核苷酸替代模型且Bootstrap值设为1000。序列分析和进化分析采用BioEdit软件和Mega6.0软件。

2、结果

2.1RD细胞病变观察

病毒液接种RD细胞48h后，显微镜下可见明显的细胞病变（CPE），与对照组细胞相比，实验组细胞出现明显的脱落、成团、破碎现象，病变程度达到莞，且病变结果高度一致。见图1。

图1CA10感染RD细胞后的CPE观察（×10)

2.2病毒鉴定及全基因序列获得

CA10基因PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，在738bp处可见特异性扩增条带，见图2，经测序和BLAST比对分析确认为CA10。利用设计好的全基因引物，经PCR扩增，成功获得CA10全基因片段，见图3，经双向测序和拼接获得来自HFMD和HA患者的CA10全基因序列CA10-HFMD和CA10-HA。

图2CA10基因扩增产物电泳图

2.3CA10-HFMD与CA10-HA基因序列及特征分析

CA10-HFMD和CA10-HA基因序列中，VP1序列全长894bp，编码氨基酸298个；全基因序列全长7411个核苷酸，编码区（CDS）编码氨基酸2193个。CA10-HFMD与CA10-HA的全基因序列核苷酸同源性为98.8%。分离的2株CA10的VP1区域核苷酸同源性为99.1%，氨基酸同源性为99.8%，存在2个非同义突变位点（Ser-Pro和Lys-Glu）；编码区核苷酸同源性为98.9%，氨基酸同源性为99.5%，存在12个非同义突变位点（Ser-Pro、Lys-Glu、CysLeu、Asn-Ser、Ser-Ala、Val-Gly、Gly-Ser、Asn-Ser、LysGlu、Asp-Gly、Thr-Ser和Val-Ala）。与CA10原型株（AY42-1767）相比，分离株的VP1区域核苷酸和氨基酸同源性分别为76.2%～76.4%和97.3%～97.4%。CA10-HFMD与CA10-HA的编码区之间存在的12个非同义突变位点分别对应598、804、1280、1427、1557、1566、1643、1725、1806、1820、1827和1928氨基酸位点，此外与CA10原型株（AY421767）相比，分别存在124和117个非同义突变位点，见图4。中国与其他国家CA10可划分为7个基因谱系（A～G），与GenBank中收录的中国及其他国家的CA10序列进行进化分析比较发现，分离的2株昆明株CA10位于G基因谱系上，且与KF-999765（北京）和JX473455（深圳）亲缘关系最近，见图5。分离株CA10全基因序列已上传NCBI数据库，基因序列登录号：MK814854(CA10-HA）和MK-814855(CA10-HFMD）。

图3CA10全基因序列的PCR扩增产物电泳图

图4CA10原型株（AY421767）及2株昆明CA10分离株的编码区（CDS）氨基酸序列比较

图52018年昆明CA10分离株的VP1基因系统进化分析

3、讨论

虽然EV71和CA16是引起我国HFMD暴发和流行的主要病原体，但最近的流行病学研究证明，CA10和CA6作为新的和重要的病原体，与全球越来越多的HFMD暴发和散发病例有关，特别是在亚太地区[15]。由CA10引起的HFMD在欧洲[16,17]、亚洲[18]和非洲[19,20]的零星发生和暴发有所增加，并且导致了巨大的疾病负担。

CA10在临床上主要导致儿童出现HFMD和HA。本研究分离自HFMD和HA的CA10系统进化分析发现，其位于同一分支且属于G基因谱系，此外在RD细胞出现的病变特征相似，核苷酸和氨基酸同源性也较高。原型株（AY421767）分离自疑似脊髓灰质炎患者，北京株（KF999765）和深圳株（JX47-3455）分离自HFMD患者。系统进化树分析发现，昆明流行株CA10与2012年分离的北京株（KF9997-65）和2011年分离的深圳株（JX473455）亲缘关系最近。本次分离的CA10流行株可能来自北京或深圳。CA10-HFMD在VP1区域与原型株（AY421767）、北京株（KF999765）和深圳株（JX473455）相比，核苷酸同源性分别为75.1%、97.4%和96.5%；氨基酸同源性分别为91.9%、98.3%和98.3%。CA10-HA在VP1区域与原型株（AY421767）、北京株（KF999-765）和深圳株（JX473455）相比，核苷酸同源性分别为76.4%、97.1%和96.3%；氨基酸同源性分别为92.3%、99.0%和99.0%。以往的研究表明，肠道病毒EV71在结构蛋白VP1，非结构蛋白2A、2C、3A和3C区域中，存在多个影响病毒毒力的候选位点[21,22,23,24,25,26]。该研究发现，分离于HFMD和HA的CA10在VP1(Ser-Pro和Lys-Glu）和编码区（Ser-Pro、Lys-Glu、CysLeu、Asn-Ser、Ser-Ala、Val-Gly、Gly-Ser、Asn-Ser、LysGlu、Asp-Gly、Thr-Ser和Val-Ala）存在的非同义突变位点是两者之间显著的差异，可能对CA10的毒力产生影响。

本研究在分子水平分析了从HFMD和HA患者分离的CA10毒株的编码基因差异，非同义突变可能是导致不同症状差异的原因。核苷酸突变引起的氨基酸替换是导致病毒毒力差异及不同症状出现的原因，因此，本文氨基酸替换导致的症状差异，值得在蛋白质水平及体内研究方面进行深入的探讨，为对CA10的进一步研究提供参考。

饶清,赵跃丽,李仁秋,蒋鸿超,孙强明,张桢.分离自手足口病和疱疹性咽峡炎患者的柯萨奇病毒A组10型病毒的基因特征及差异分析[J].中国生物制品学杂志,2020,33(08):867-873.

基金:云南省教育厅科学研究基金项目(2018JS241);云南省儿科临床疾病医学中心科技项目(YPMC-2019-07);昆明市卫生科技人才培养项目暨“十百千“工程内设研究机构,昆明市儿童罕见病诊断与家系基因测序研究中心(2017-SW-02);昆明市科技计划项目(2017-1-S-15381);中国医学科学院创新工程项目(2016-I2M-1-19).