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HEVORF2截短融合蛋白的免疫原性检测

2020-08-12 615 上传者：管理员

摘要：目的：原核表达3型戊型肝炎病毒第2个开放阅读框截短融合蛋白，并检测其免疫原性。方法：分别扩增HEV3-179和Fe蛋白基因片段，经OverlapPCR法连接并扩增，克隆至载体pET-28a，构建重组表达质粒pET-28a-HEV179-Fe，将其转化感受态E.coliBL21(DE3），取阳性菌株，IPTG诱导表达融合蛋白HEV3-179-Fe，进行10%SDS-PAGE分析。目的蛋白经镍离子金属鳌合亲和层析纯化后，加入硫酸铵进行病毒样颗粒（virus-likeparticles,VLPs）重构，置电镜下观察。HEV3-179-Fe蛋白VLPs与氢氧化铝佐剂吸附后免疫小鼠，ELISA法测定效价，以评价HEVORF2截短融合蛋白的免疫原性。结果：重组表达质粒pET-28a-HEV3-179-Fe构建正确。目的蛋白HEV3-179-Fe相对分子质量约40000，主要以包涵体形式存在，表达量均达35%以上，纯度约95%，可与鼠抗HEV3多抗发生特异性反应。硫酸铵重构后于电镜下可见直径约20nm的VLPs，其免疫小鼠的血清效价达1∶4800000以上。结论：原核表达了HEV3-179-Fe，且在小鼠体内具有较好的免疫原性。本实验为以HEVORF2-179蛋白为基础的VLPs基因工程疫苗的研发奠定了基础。

关键词：
免疫原性
原核表达
基因重组
戊型肝炎病毒
截短融合蛋白
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戊型肝炎是由戊型肝炎病毒引起的肠道传播的急性肝炎，常引发大规模暴发，对孕产妇及胎儿的危害尤为严重。目前，尚无针对戊型肝炎的特效药物，接种疫苗是控制HEV传播的重要途径，但由于戊型肝炎不能在体外连续传代培养，无法研制传统的灭活及减毒疫苗，基因工程疫苗成为研究热点[1]。HEV第2个开放阅读框含有中和表位，是目前已上市和研发中戊型肝炎疫苗的候选表位[2]。

铁蛋白是幽门螺旋杆菌内所含有的蛋白，截短的铁蛋白能够天然形成24聚体，构成直径约20nm的颗粒，与其他蛋白融合表达也可形成颗粒并可辅助蛋白抗原表位的呈现[3]，现已应用于多种基因工程疫苗的研发。

本研究以3型HEV(HEV3)ORF2179蛋白为基础，将其与铁蛋白融合，并在E.coli系统中进行高效表达，经纯化获得高纯度蛋白，加入适量硫酸铵进行颗粒重构，形成高免疫原性的病毒样颗粒，为戊型肝炎基因工程疫苗的研发奠定基础。

1、材料与方法

1.1质粒及菌株

质粒5R-3R-7Z（含HEV3完整基因组）及质粒Fe-pET-28a由长春生物制品研究所（简称长春生物）生物技术室构建并保存，载体pET-28a、感受态E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3）由该室保存。

1.2实验动物

SPF级NIH小鼠，雌性，18～20g,6～8周龄，购自长春生物动物室，动物许可证号为：SCXK（吉）-2019-0005。

1.3主要试剂及仪器

Thermoscientificpfu-DNA聚合酶购自美国ThermoFisher公司；限制性内切酶NdeⅠ和HindⅢ、T4DNA连接酶均购自日本TaKaRa公司；凝胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒均购自美国Axygen公司；IPTG购自美国Sigma公司；鼠抗HEV3多抗及重组蛋白HEV3-179由长春生物保存；HRP标记的羊抗鼠IgG和Western底物均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；增强型DAB显色液购自北京索莱宝生物科技有限公司；高压均质机购自美国ATS公司；AKTA纯化系统购自美国GE公司。

1.4引物设计及合成

根据GenBank中登录的HEV(KX981911.1）和Fe(KF356054.1）基因序列，应用PrimerPremier5.0软件设计2对引物：CCJD-179PF/HEV3-OVERLAP-R和HEV3-OVERLAP-F/Fe-R，并在引物CCJD-179PF与Fe-R的5′端分别引入NdeⅠ和HindⅢ酶切位点，其中引物HEV3-OVERLAP-F与HEV3-OVERLAP-R含有16bp的互补区。见表1。引物均由吉林省库美生物科技有限公司合成。

1.5目的基因的扩增

以质粒5R-3R-7Z和Fe-pET-28a为模板，分别采用引物CCJD-179PF/HEV3-OVE-RLAP-R、HEV3-OVERLAP-F/Fe-R扩增HEV3-179和Fe基因。PCR反应条件均为：98℃预变性2min;98℃变性20s,45℃退火20s,72℃延伸20s，共30个循环；72℃再延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳纯化回收。以扩增产物HEV3-179和Fe片段为模板，采用引物HEV3-OVERLAP-F、HEV3-OVERLAP-RF扩增HEV3-179-Fe融合片段。PCR反应条件为：98℃预变性2min;98℃变性20s,45℃退火30s,72℃延伸1min，共30个循环；72℃再延伸10min。PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.6重组表达质粒的构建

胶回收产物与载体pET-28a分别经限制性内切酶NdeⅠ和HindⅢ双酶切，回收的目的基因片段及载体片段，以T4DNA连接酶于16℃连接过夜；将连接产物转化感受态E.coliDH5α，经卡那霉素抗性（50μg/mL）选择培养，挑取单克隆，进行菌落PCR鉴定。提取阳性菌株的重组质粒，送吉林省库美生物科技有限公司进行测序。将测序正确的重组表达质粒命名为pET-28a-HEV179-Fe。

1.7目的蛋白的诱导表达

将重组表达质粒pET-28a-HEV3-179-Fe转化感受态E.coliBL21(DE3），经卡那霉素抗性（50μg/mL）选择培养，挑取单克隆，接种于LB液体培养基，于37℃培养6h；转接至1L摇瓶培养。当A600=0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L,37℃诱导5h；取1mL菌液，超声破碎，12000×g离心1min，分别取上清及沉淀，进行10%SDS-PAGE鉴定，蛋白胶经ImageLab3.0软件分析，条带检测灵敏度设置为25。

表1引物序列

1.8目的蛋白的纯化

将诱导后的重组菌液于4℃，10000×g离心30min，收集菌体，按1∶10(W/V）比例加入50mmol/LTris-HCl(pH8.0）重悬，800bar条件下均质3次；10000×g离心20min，收集沉淀（即包涵体），用含8mol/L尿素（pH8.0)Tris-HCl重悬，4℃放置过夜；用0.45μm滤膜抽滤，收集滤液。采用AKTA纯化系统进行镍离子金属鳌合亲和层析纯化，经3个体积的50mmol/L(pH8.0）的Tris-HCl平衡Ni-NTA介质，上样流速为1mL/min，用含50、100、300mmol咪唑的洗脱液梯度洗脱目的蛋白，经10%SDS-PAGE鉴定，应用ImageLab3.0软件分析，条带检测灵敏度设置为25。经10%SDS-PAGE分离蛋白后，转至PVDF膜，用含20%血清的PBS封闭1h;PBST洗涤3次，加入鼠抗HEV3多抗（1∶2000稀释），37℃孵育1h;PBST洗涤3次，加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶8000稀释），37℃孵育1h;PBST洗涤5次，DAB显色。

1.9VLPs的重构

向纯化目的蛋白中加入硫酸铵至终浓度为0.5mol/L。滴加复性液（50mmol/LTris-HCl,2mmol/LGSH,0.2mmol/LGSSH,0.5mol/LL-Arg,pH7.0），同时搅拌，至尿素浓度低于2mol/L后，将蛋白在复性液中进行透析复性，透析袋置聚乙二醇20000中浓缩。

1.10电镜观察

重构的HEV3-179-Fe蛋白滴加至铜网上，置1%磷钨酸溶液中复染5min，透射电镜下观察VLPs的形成情况。

1.11免疫原性评价

1.11.1动物分组及免疫

用铝佐剂分别吸附HEV3-179及HEV3-179-Fe蛋白，使铝终浓度为10mg/mL,HEV3-179终浓度为60μg/mL、HEV3-179-Fe终浓度为120μg/mL。将18只小鼠随机分为3组，每组6只，经背部皮下分别免疫上述2种含铝佐剂的抗原和10mg/mL的铝佐剂，免疫剂量为100μL/只，同时设佐剂对照组。0、2、4周各免疫1次，于初免后第5周经眼眶后静脉丛采血，分离血清。

1.11.2血清抗体效价检测

采用间接ELISA法。用HEV3-179蛋白包被酶标板，0.3μg/孔，4℃包被18h；加入含10%小牛血清的PBS,100μL/孔，4℃封闭24h；加入血清（1∶10稀释），100μL/孔，37℃孵育1h；用PBST洗涤3次，加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶10000稀释），100μL/孔，37℃孵育1h；用PBST洗涤5次，加入四甲基联苯胺底物显色，50μL/孔，37℃孵育10min；加入2mol/L浓硫酸，50μL/孔，终止反应；用酶标仪测定A450值。以大于Cutoff值（阴性孔A450值×2.1）的最大稀释度为其效价。

1.12统计学分析

应用SPSS19.0及EXCEL统计学软件进行统计分析，试验数据采用几何平均抗体滴度表达，疫苗免疫结果组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1目的基因扩增产物的鉴定

HEV3-179和Fe基因PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见约550bp目的基因条带，大小均与预期相符，见图1。HEV3-179-Fe融合基因片段PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见约1100bp的特异条带，大小与理论值相符，见图2。

图1HEV3-179(A）和Fe基因（B）的PCR产物电泳图

图2HEV3-179-Fe融合基因片段PCR产物电泳图

2.2重组表达质粒的鉴定

重组表达质粒pET-28a-HEV3-179-Fe转化菌落PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，8号菌落呈阳性，可见约1100bp的特异条带，大小与理论值相符，见图3。测序结果表明，重组表达质粒pET-28a-HEV3-179-Fe构建正确。

图3pET-28a-HEV3-179-Fe重组菌的PCR鉴定

2.3表达产物的鉴定

重组蛋白HEV3-179-Fe相对分子质量约40000，大小与预期相符，主要以包涵体形式存在，见图4。表达量约35.9%，见图5。

图4HEV3-179-Fe蛋白的SDS-PAGE分析

图5HEV3-179-Fe蛋白表达量分析

纯化蛋白HEV3-179-Fe包涵体变性后经镍柱纯化，100mmol/L咪唑的洗脱峰最大，含有目的蛋白，见图6；纯化蛋白相对分子质量约40000，大小与预期相符，见图7；纯度约95%，见图8；可与鼠抗HEV3多抗发生特异性结合，于相对分子质量约40000处可见特异性结合条带，见图9。

图6亲和层析洗脱曲线图

图7纯化产物的SDS-PAGE分析

图8纯化产物纯度分析图

图9纯化产物的Westernblot鉴定

2.5HEV3-179-Fe蛋白VLPs的电镜观察

可见直径约20nm的颗粒，大小均匀，形态饱满圆润，密度极高，见图10。

图10HEV3-179-Fe蛋白VLPs的电镜观察

2.6融合蛋白的免疫原性

HEV3-179组、HEV3-179-Fe组及佐剂对照组小鼠血清效价分别为1∶775000、1∶4800000及1∶10。与佐剂对照组比较，HEV3-179组、HEV3-179-Fe组小鼠血清效价明显升高（t分别为0.014和0.002,P<0.01）。

3、讨论

HEV是单股正链RNA病毒，目前尚无可支持HEV增殖的稳定细胞系[4]，已上市的和在研的戊型肝炎疫苗多数为基因工程疫苗[5]。HEV有3个ORF[6,7]，其中ORF2含有中和表位，是重组疫苗的首选区域[8,9]。目前，全球唯一上市的戊型肝炎疫苗（益可宁），抗原表位选自ORF2的368～606位肽段，临床数据显示具有良好的免疫效果[10]。有研究表明，利用4型HEVORF2第439～617位编码的蛋白以可溶形式表达天然HEV重组蛋白，其在表达过程中可自主组装为VLPs，并能刺激机体产生高的效价[11,12]。

VLPs是含有病毒结构蛋白的空心颗粒[13]，由于其不含有病毒核酸，因此不能复制，结构与病毒相似，通常可引发强的免疫反应[14]，是构建基因工程重组疫苗的基础[15,16]。未用硫酸铵处理的蛋白单纯复性不能形成颗粒，加入硫酸铵处理后的蛋白可形成紧密的颗粒。一般认为疏水性是VLPs组装的基础[17]，在蛋白复性过程中加入一定浓度的硫酸铵能够帮助其重组形成颗粒。由于HEV3-179蛋白本身可以天然形成颗粒[11]，其在融合蛋白表达应用广泛[18]，铁蛋白也可天然形成颗粒，该融合蛋白的颗粒存在形式有待进一步确证。

本研究中，HEV3-179-Fe蛋白的原核表达量高，Westernblot结果显示重构后的颗粒能够与HEV3抗体产生结合反应，表明该蛋白能够正常呈现HEV抗原表位，经动物实验检测，证实其能够刺激机体产生强的体液免疫应答，为进一步研制戊型肝炎基因工程疫苗提供了依据。

参考文献：

[9]童彦军,谢溱,蒋琳.病毒样颗粒及其疫苗研究[J].微生物学免疫学进展,2015,43(4):69-74.

[18]陈剑惠,张宏,翁美榕.戊型肝炎疫苗与乙型肝炎疫苗联合接种的安全性[J].解放军预防医学杂志,2016,34(3):447.

周永飞,乔宏雷,赵丹莹,唐剑光,常东英,韩顺子,常军亮,张健,刘玉林,曹玉锋.HEVORF2截短融合蛋白的原核表达及其免疫原性[J].中国生物制品学杂志,2020,33(08):880-884+889.