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Kaposi肉瘤组织中长链非编码RNA的表达

2020-08-12 188 上传者：管理员

摘要：目的:检测长链非编码RNA(lncRNA)在Kaposi肉瘤组织和瘤旁正常组织中的表达。方法:利用高通量lncRNA芯片技术检测5例Kaposi肉瘤组织及其瘤旁正常组织的lncRNA表达谱,筛选差异表达的lncRNA,并利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法进一步验证芯片结果,同时采用生物信息学分析差异lncRNA靶基因KEGG通路注释。结果:与正常组织相比,Kaposi肉瘤组织中共筛选出717个差异表达的lncRNA,其中上调表达408个,下调表达309个;与正常组织相比,lnc-PXDN-3:3和lnc-PERP-10:2在Kaposi肉瘤组织中均表达上调,与芯片结果一致。生物学过程注释集中在Wnt信号通路、泛素化代谢、TGF-beta信号通路、P53信号通路。结论:lncRNA可能与Kaposi肉瘤发病有关。

关键词：
Kaposi肉瘤
基因芯片
实时荧光定量PCR
长链非编码RNA
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Kaposi肉瘤是一种罕见的低度恶性的血管肉瘤,病因和发病机制尚未完全明确[1]。近年来,随着高通量测序技术的发展,非编码RNA被发现在肿瘤的发病机制中起到一定作用,并成为目前研究的热点,miRNA已经证实与Kaposi肉瘤发生发展有关[2,3,4]。lncRNA占非编码RNA80%以上,可能有比miRNA更复杂的作用,许多研究提示其可能成为肿瘤治疗新的靶点[5,6]。本研究通过应用高通量lncRNA芯片技术筛选出Kaposi肉瘤组织与瘤旁正常组织差异表达的lncRNA,聚类(GO)分析筛选出与Kaposi肉瘤相关的lncRNA,为进一步阐明Kaposi肉瘤的发病机制提供实验依据。

1、资料与方法

1.1一般资料

收集2016年3～7月新疆维吾尔自治区人民医院皮肤科经临床和病理确诊的5例Kaposi肉瘤患者瘤体和瘤旁正常皮肤组织,所有标本一经离体立即投入冻存管中,于液氮中保存。所有患者于取材前3个月未系统使用过免疫调节剂、糖皮质激素等治疗,且停止紫外线光疗及外用药物治疗至少1个月;所有标本均经过2位高年资皮肤病理专家阅片证实。本研究获新疆维吾尔自治区人民医院伦理委员会批准,所有患者均填写卡波西肉瘤流行病调查表,并签署知情同意书。5例Kaposi肉瘤患者中,男3例,女2例;年龄平均(57±20.34)岁;均为维吾尔族;均为经典型Kaposi肉瘤。

1.2实验材料

样本组织总RNA的提取试剂RNAisoPlus(TAKARA),质检Bioanalyzer2100,RNA纯化试剂盒RNeasyminikit(QIAGEN),cRNA合成和标记试剂盒(Agilenttechnologies),SYBRGreenI(Takara),紫外分光光度计ND-2000(NanoDrop),ABI7500荧光定量PCR仪(AppliedBiosystems),lncRNA芯片杂交盒(Agilenttechnologie),芯片扫描仪(Agilenttechnologies)。lncRNA芯片为上海伯豪公司的4×180khumanceRNA表达芯片。

1.3实验方法

1.3.1组织总RNA的抽提和纯化

取液氮冻存的Kaposi肉瘤和瘤旁正常组织,采用TAKARARNAisoPlus并且根据生产厂商提供的标准操作流程进行样品的totalRNA抽提,抽提所得totalRNA质检合格后使用RNeasyminikit和RNase-FreeDNaseSet进行总RNA的纯化。NanoDropND-2000紫外分光光度仪检测样本总RNA,样本OD260/280均在1.7～2.1,说明RNA纯度高,28S/18S≥0.7/OD为合格,满足芯片实验要求,见表1。

表1测序样本总RNA质检结果

1.3.2芯片杂交、扫描及数据读取分析

实验样品RNA采用LowInputQuickAmpWTLabelingKit和标准操作流程对样品总RNA进行放大和标记,并用RNeasyminikit纯化标记后的cRNA。按照Agilent表达谱芯片配套提供的杂交标准流程和配套试剂盒GeneExpressionHybridizationKit组装好杂交仓,将标记后的样本置于滚动杂交炉中65℃,10rpm,滚动杂交17h,杂交cRNA上样量1.65μg,并在洗缸中洗片,洗片所用的试剂为GeneExpressionWashBufferKit。杂交后的芯片采用AgilentMicroarrayScanner进行扫描。用FeatureExtractionsoftware10.7读取数据,最后采用R软件中limma包进行归一化处理,分别绘制散点图、火山图和热图,并进行GO分析和KEGGpathway分析。

1.3.3qRT-PCR

用研磨仪将组织样本研磨均匀,以Takara公司的RNAisoPlus提取总RNA,并用NanoDropND-2000紫外分光光度仪测定产物的浓度和纯度。按PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser(PerfectRealTime)的说明书进行逆转录合成cDNA。以人β-actin为内参基因,用SYBR®PremixExTaqTMII(TliRNaseHPlus)在美国ABI7500系统中进行PCR扩增,实时采集荧光信号用ΔCt值代表基因的相对定量值,用2-ΔΔCt值表示基因表达的差异倍数:ΔCt值=样本基因的Ct值-同组β-action的Ct值,ΔΔCt值=各个样本的ΔCt值-瘤旁正常组织的ΔCt值的平均值。引物序列:lnc-PXDN-3:3的上游序列ACCTTCCAGCCTTTGTCCTT,下游序列TACCCGAGCATCCACTTAGG;lnc-PERP-10:2的上游序列TCTCCCAGCCTCTCAAAACAG,下游序列AAACCAAGACCCTTCTACCTCTGA;β-action的上游序列TGACTTCAACAGCGACACCCA,下游序列CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA。

1.4统计学方法

以SPSS17.0软件对数据进行统计学分析,计量资料采用独立样本t检验分析,以P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1样本总RNA抽提质检结果

根据OD260/OD280(260nm代表核酸的值,280nm为蛋白质的值),该比值介于1.7～2.0时判定该样本总RNA质量合格。RNAIntegrityNumber(RIN)代表总RNA的完整性,RIN≥7.0为完整性好,RIN在6.0～7.0表示存在部分降解,RIN<6.0表示RNA降解。28S/18S≥0.7为合格。所有样本RNA质检均合格。

2.2lncRNA在Kaposi肉瘤中差异表达谱分析

通过lncRNA微阵列芯片检测比较Kaposi肉瘤皮损及皮损旁组织之间差异表达的lncRNA表达谱。比较Kaposi肉瘤组织及正常组织中的lncRNA表达水平,将差异表达倍数≥1.5且P<0.05的lncRNA定义为差异表达lncRNA,结果筛选出差异表达lncRNA共717个,其中在Kaposi肉瘤组织中上调表达的lncRNA有408个,下调表达的有309个。部分差异表达的lncRNA,见表2。

2.3lncRNA差异表达聚类图

lncRNA在Kaposi肉瘤组织标本(group1,g1)和瘤旁正常组织标本(group2,g2)中呈离散分布(图1)。以差异倍数≥1.5且P<0.05为筛选标准筛选出Kaposi肉瘤组织与正常组织差异表达的lncRNA,其中红色区域表示表达上调和蓝色区域表示表达下调(图2)。聚类分析直观显示每个样本中不同lncRNA的表达水平,红色表示高表达转录本,绿色表示低表达转录本,灰色部分表示无显著性差异,两组样本中lncRNA的表达存在差异(P<0.05),见图3。

图1Kaposi肉瘤和瘤旁组织差异表达的lncRNA散点图

图2Kaposi肉瘤和瘤旁组织差异表达的lncRNA火山图

图3Kaposi肉瘤组织与瘤旁正常组织差异表达的lncRNA聚类分析图

2.4qRT-PCR验证

为进一步验证基因芯片结果,选取差异lncRNA:lnc-PXDN-3:3和lnc-PERP-10:2,采用qRT-PCR在原有5对组织标本中检测lncRNA表达水平,结果发现表达趋势与芯片结果一致,每个实验进行3个生物学重复,差异均有统计学意义,间接证明芯片分析数据结果的可靠性。见表3。

表3Kaposi肉瘤组织和瘤旁正常组织中2个lncRNA的表达差异

2.5差异表达的lncRNA的靶基因预测

对于lncRNA靶向位点的预测,我们先依据人类不同lncRNA数据库,结合芯片注释给出的lncRNA编号名称以及坐标,获取差异表达的lncRNA序列。选取与lncRNA距离小于10kb的基因作为顺式作用元件(cis-elements)靶基因;再选出与差异表达的lncRNA序列具有互补性或相似性的序列,利用RNAplex计算两序列之间的互补能量,选择e≤-30的序列作为反式作用因子(trans-elements)作用靶基因,部分结果见表4。然后,根据生物信息学分析,对cis调控及trans调控的靶基因进行KEGG通路注释(图4、5)。

表4Kaposi肉瘤组织部分差异表达的lncRNAs的靶基因预测

图4Cis靶基因富集KEGG通路分析图

图5Trans靶基因富集KEGG通路分析图

3、讨论

Kaposi肉瘤是一种多发性特发性血管肉瘤,好发于双下肢和足部的皮肤,内脏少见,发展缓慢,临床上分为四型:经典型、艾滋病相关型(AIDS-KS)、非洲型和免疫抑制型。其病因未明,Kaposi肉瘤病毒感染(KSHV)是目前比较明确的病因之一,它编码了12种成熟miRNA,其中kshv-mir-k12-1和kshv-mir-k12-12在Kaposi肉瘤组织中呈高表达[7],kshv-mir-k12-1-5p可能通过靶向抑制CDKN1A的表达影响Kaposi肉瘤的细胞周期。然而,不是所有感染KSHV者都会发生Kaposi肉瘤,人内源性逆转录病毒K(HERV-K)的活化可能起到了一定的促进作用,而且并非所有的Kaposi肉瘤都存在KSHV感染[8]。Kaposi肉瘤发生有明确的地区分布和种族差异,在我国主要发生于新疆地区维吾尔族人群中,吴秀娟等[9]对该地区Kaposi肉瘤组织进行miRNA芯片研究,发现了差异表达的miRNA,进一步研究提示miR-126可能是Kaposi肉瘤的一种抑癌基因。

目前研究表明有超过90%的人类基因组可以转录为RNA,但是其中只有2%可翻译为蛋白质,98%的转录产物为不编码蛋白的非编码RNA,如miRNA、lncRNA等。近年来非编码RNA成为研究的热点[10],而Kaposi肉瘤中的lncRNA与Kaposi肉瘤的关系研究较少。长链非编码RNA(longnoncodingRNA,lncRNA)是一类长度超过200个核苷酸的线性非编码RNA转录本,可通过顺式(incis)或反式(intrans)作用调节来调控靶基因的表达。近年来,越来越多的研究证实lncRNA在肿瘤等疾病的发生发展的中发挥着重要作用[11,12,13]。

本研究通过lncRNA芯片分析了Kaposi肉瘤组织和正常组织中lncRNA表达谱的差异变化,按照表达差异倍数≥1.5倍且P<0.05进行筛选,共得到717个差异表达的lncRNA,其中在Kaposi肉瘤组织中上调409个,下调308个,与正常组织相比,Kaposi肉瘤组织中存在明显的lncRNA差异表达,提示lncRNA可能参与了Kaposi肉瘤的发病过程。

利用生物信息学技术对差异表达的lncRNA进行靶基因预测,结果显示差异表达的lncRNA可能通过cis和trans两种方式对靶基因进行调控。同时我们挑选了在Kaposi肉瘤组织中上调表达的lnc-PXDN-3:3和lnc-PERP-10:2通过qRT-PCR在5对样本组织中进一步验证芯片结果的准确性,结果与芯片检测结果一致。在Kaposi肉瘤lncRNA网络的KEGG功能注释中发现涉及到Wnt信号通路、泛素化代谢、TGF-β信号通路、p53信号通路等,这些信号通路是重要的细胞增殖、分化与凋亡的关键调节通路,与多种肿瘤密切相关。有研究证实乳腺癌中lncRNACRNDE能通过竞争抑制miR-136激活Wnt/β-catenin信号,从而促进肿瘤细胞增殖[15],而lncRNAHIT对TGF-β介导的乳腺癌细胞的侵袭转移具有显著的促进作用[16]。胃癌组织中明显低表达的lncRNATUSC7,是p53的直接转录靶点,可以通过抑制miR-23b的方式来抑制肿瘤细胞的生长和增殖[17]。也有研究显示lncRNA可促进蛋白泛素化,增强肿瘤细胞的侵袭能力[18]。抑癌基因转化生长因子II型受体(TGF-βRII)在Kaposi肉瘤瘤体中低表达,考虑与Kaposi肉瘤的发生有关[19]。Chudasama等[20]证实了KSHV的结构蛋白能在裂解后期表达,并被整合到KSHV病毒颗粒中,抵抗p53诱导的细胞凋亡。KSHV基因编码的蛋白能直接或间接作用于多种信号通路,进而参与病毒相关疾病的发病机制中[21]。因此,我们猜想本研究发现的lncRNA通过这些通路作用于KSHV或者Kaposi肉瘤瘤体本身,进而影响Kaposi肉瘤的发生发展,但具体机制仍需要进一步研究。

本实验初步探索lncRNA在Kaposi肉瘤中的表达情况,为进一步研究lncRNA在Kaposi肉瘤发病机制中的作用提供了一定的实验依据,后续我们将深入研究lncRNA在Kaposi肉瘤发病过程中的作用,为Kaposi肉瘤的诊断和治疗提供新的靶点。

参考文献：

[3]张静,吴秀娟,普雄明.kshv-mir-k12-1-5p相关基因在卡波西肉瘤中的表达[J].山西医科大学学报,2017,48(10):74-77.

[7]吴秀娟,赵宗峰,普雄明.Kaposi肉瘤相关疱疹病毒8型相关微小RNAk12-1和k12-12在Kaposi肉瘤组织中的表达及意义[J].中华皮肤科杂志,2015,48(12):860-863.

[9]吴秀娟,丁媛,普雄明,等.微小RNA-126对卡波西肉瘤细胞迁移和侵袭能力的影响[J].中华实用诊断与治疗杂志,2017,31(1):26-28.

[10]甘泉,周晓伟,刘毅,等.长链非编码RNA在皮肤癌中的研究进展[J].中国麻风皮肤病杂志,2017,33(4):249-253.

刘治全,袁虎,普雄明.长链非编码RNA在Kaposi肉瘤组织中的表达[J].中国麻风皮肤病杂志,2020,36(08):467-472.