雄激素性脱发是一种好发于中青年男性的最常见的脱发性疾病,发病率高,对患者心理、社交产生严重的影响。目前AGA治疗主要方法包括:(1)外用米诺地尔,通过开放细胞膜上K离子通道,产生血管舒张效应;(2)口服非那雄胺,阻断睾酮转变为二氢睾酮从而减弱雄激素对毛囊的抑制作用;(3)口服西咪替丁、安体舒通等雄激素受体竞争剂;(4)自体毛发移植。药物常有不同程度的不良反应如局部接触性皮炎、多毛症、性功能障碍、心肌梗塞和厌食等,并且不能阻断病程,也无法诱导毛囊的再生,治疗时间长,停药后常复发。而毛囊移植操作创伤大、毛囊存活率有限。因此寻找一种安全性高、可以促进毛囊再生的方法一直是雄激素性脱发的研究热点。

目前Yang等[1]研究发现在男性雄激素性脱发中,体重指数较高的人可能会有更严重的脱发,尤其是发病年龄较早的患者。并且AGA受试者中血浆瘦素水平显著高于非-AGA的受试者,且瘦素水平与严重程度成正相关[2],但目前基础研究中瘦素更多的被认为是一种毛囊生长期的诱导剂[3]。例如研究发现瘦素在毛乳头细胞的退行期、静止期和生长期早期均有表达[4]。研究发现,5周大的C57/BL6老鼠被毛毛囊已经处于第一个生长期的后期,但瘦素受体缺乏的db/db转基因老鼠毛囊仍在第一个静止期,而在7周大野生型老鼠剃毛的背部皮肤中注射瘦素20天后,注射区毛发生长,而db/db转基因老鼠局部注射瘦素未见毛发生长[5]。瘦素水平在毛囊生长期初期最低,在生长期后期逐渐升高,静止期阶段中最高,也表明瘦素可能是毛囊进入生长期诱导剂[6]。糖皮质激素及卵巢性激素均可刺激瘦素分泌,而雄激素则抑制其分泌[7],同时有研究报道缺乏雄激素性受体老鼠会变得肥胖[8]。因此我们猜测AGA患者由于局部雄激素增高、雄激素受体功能增强可能降低局部脂肪细胞中瘦素的表达,抑制了JAK2-STAT信号通路的活性,从而影响毛囊细胞的生长周期及迁移等,最终导致AGA患者出现脱发。基于此我们试图通过外源性补充瘦素以达到治疗雄激素性脱发的目的。

1、材料和方法

1.1实验动物、试剂及仪器

1.1.1实验动物

40只C57雄性小鼠,体重20～22g,12周左右,购于成都达硕实验动物有限公司,动物生产许可证:SCXK(川)2015-030,动物使用许可证:SCXK(川)2019-189。

1.1.2主要实验试剂

丙酸睾酮注射液(1mL:25mg,10支/盒,杭州动物药品厂)、5%米诺地尔酊(蔓迪,90mL,浙江万晟药物有限公司)、重组小鼠瘦素蛋白(CF,498-OB-05M,R&Dsystem)、anti-GAPDH(abcam,EPR16891)、anti-AR(abcam,AB198394)、anti-Ki67(abcam,ab92742)、羊抗兔IgG(博奥森生物,bs-0295G-HRP)、羊抗鼠IgG(博奥森生物,bs-0296G-HRP)、全蛋白提取试剂盒(凯基生物,KGP2100)、ECL化学发光液(博奥森,C05-07004)、广谱SP免疫组化检测试剂盒(博奥森生物,SP-0022)、HEStainingKit(博奥森生物,C02-04004)、tunnel试剂盒(凯基生物,KGA7071)。

1.1.3实验仪器

荧光显微镜(IX81,日本奥林巴斯)、Image-ProPlus(MediaCybernetics,SilverSpring,MD,USA)、凝胶成像系统(UVP,EC3300,美国)。

1.2实验动物分组及处理

实验将40只12周雄性C57小鼠按体重编号后随机分组,空白组10只、模型组10只、米诺地尔组10只、瘦素组10只,饲养于温度(23±2)℃,湿度(54±10)%环境,自由饮食、饮水。除空白组外,均选小鼠背部给与药物皮下注射,均予以注射丙酸睾酮5mg/kg·d,4周建模成功后,模型组仅继续注射丙酸睾酮5mg/kg·d,米诺地尔组予以注射丙酸睾酮5mg/kg·d+外用5%米诺地尔酊0.2mL/d,瘦素组予以注射丙酸睾酮5mg/kg·d+重组小鼠瘦素20μg,每日1次,再连续4周。

1.3标本获取与处理

1.3.18周后肉眼观察毛发生长情况并行照相存档。

HE染色进行毛囊形态调查:实验第8周结束时,留取各组小鼠背部脱发区皮肤约1cm×1cm后行组织HE染色,观察小鼠毛囊形态学变化,100倍显微镜视野下,平均3个不重叠视野,1mm皮肤长度范围内利用Image-ProPlus(MediaCybernetics,SilverSpring,MD,USA)测量毛囊长度及大小,统计生长期毛囊数量与休止期毛囊数量比值(A/T)。

1.3.2Ki67增殖及tunnel凋亡检测

(1)Ki67免疫组化染色观察毛囊细胞增殖情况:毛囊切片1%甲醛固定,常规脱水,包埋,切片,脱蜡复水,抗原修复,然后与兔抗小鼠Ki67抗体(anti-Ki67,ab92742,abcam,USA)孵育,DAB显色。(2)tunnel荧光染色观察毛囊细胞中凋亡细胞碎片:通过抗地高辛配基异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔抗体显示,用DAPI细胞核染色。Ki67和tunnel的阴性对照组分别为省略兔抗小鼠Ki67抗体或TdT-酶。每只随机选取免疫组化切片,阳性染色区,5个不重复视野,分别对毛囊上皮中阳性细胞进行观察,图像分析Image-ProPlus(MediaCybernetics,SilverSpring,MD,USA)分析积分光密度值,统计学分析。

1.3.3局部AR受体Westernblot检测

选取各组小鼠背部脱发皮肤,生理盐水迅速冲洗,放入液氮中保存,采用凯基蛋白提取试剂盒提取全蛋白,采用BCA法进行蛋白定量,室温封闭120min,一抗:兔抗鼠AR、兔抗鼠GAPDH室温孵育30min后4℃过夜,二抗羊抗兔1∶4000室温孵育1h,暗室曝光,凝胶成像系统(UVP,EC3300,美国)采集图像并计算各组灰度值。

1.4统计学方法

使用SPSS19(Inc.,Chicago,USA)及GraphPadPrism5(GraphPadSoftware,Inc.,LaJolla,CA,USA)软件分析结果。数据表示为(x±s)。使用单因素方差分析对各组指标进行比较。检测水平P<0.05差异有统计学意义。

2、结果

2.1肉眼观察脱发情况

8周后模型组较空白组相比脱发面积明显增加,米诺地尔组及瘦素组与模型组相比脱发面积均明显缩小,各组用药区无红肿、糜烂、渗出、溃疡等情况,见图1。

图18周后各组小鼠脱发情况:模型组毛发明显脱落,融合成片,米诺地尔及瘦素组背部毛发略减少

2.2HE观察各组生长期/休止期毛囊数比例

8周后模型组较空白组生长期/休止期毛囊数比值明显降低(P<0.05),米诺地尔组与瘦素组较模型组生长期/休止期毛囊数比值明显增加(P<0.05),且米诺地尔组与瘦素组之间无统计学差异(P>0.05)。见图2、表1。

表1各组A/T值

图28周后各组小鼠脱发区皮肤HE染色(HE,×100)

2.3瘦素对毛囊细胞增殖作用的影响

模型组、米诺地尔组及瘦素组Ki67表达均较空白组低(P<0.05),米诺地尔组及瘦素组较模型组相比Ki67表达增高(P<0.05),瘦素组与米诺地尔组相比Ki67表达降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。见图3、表2。

图38周后各组小鼠脱发区Ki67表达情况:模型组(3b)毛囊细胞Ki67表达较空白组(3a)明显降低,米诺地尔组(3c)及瘦素组(3d)Ki67均为高表达(免疫组化,×100)

表2各组Ki67表达情况

2.4瘦素对毛囊细胞凋亡情况的影响

Tunnel结果显示模型组凋亡细胞数量较空白组明显增加(P<0.05),米诺地尔组较空白组相比凋亡细胞数量无明显差别(P>0.05),但较模型组相比凋亡表达减少(P<0.05),瘦素组较空白组凋亡表达无统计学差异(P>0.05),但较模型组凋亡表达同样明显降低(P<0.05),且米诺地尔组与瘦素组相比无明显统计学差异(P>0.05),见图4、表3。

表3各组凋亡表达结果

图48周后各组小鼠脱发区tunnel表达情况:模型组(4b)tunnel染色阳性细胞较空白组(4a)增多,而米诺地尔组(4c)及瘦素组(4d)阳性细胞率均较模型组减少(免疫荧光,×100)

2.5瘦素对雄激素性受体的影响

模型组、米诺地尔组及瘦素组较空白组相比AR受体表达升高(P<0.05),但米诺地尔组与模型组相比及瘦素组与模型组相比,均无统计学意义(均P<0.05),见图5、表4。

表4各组雄激素受体表达结果

图5各组AR受体WB结果(A为空白组、B为模型组、C为米诺地尔组、D为瘦素组)

3、讨论

瘦素(leptin)是一种16KD蛋白质,它是一种激素或细胞因子,主要由脂肪细胞分泌,由肥胖基因(ob)编码。在下丘脑中,瘦素与受体结合后发挥其主要效应-抑制摄食行为,促进代谢,调节全身能量平衡。因此目前将瘦素用于治疗全身脂肪代谢障碍的1型糖尿病患者的有效性已有报道[9]。随着脂肪生物学研究深入,人们发现皮肤和毛囊也可分泌瘦素,同时瘦素也可以通过多种途径参与皮肤的生理病理过程,虽然瘦素对皮肤相关性疾病的治疗作用目前仍处于空白,但关于瘦素及受体与皮肤及相关疾病的关系逐渐被报道。例如Cerman[10]及黄朝卫等[11]研究证实重度银屑病患者血清瘦素、组织中瘦素、瘦素受体表达明显高于轻度、中度银屑病患者及对照组。毕桂姣[12]发现天疱疮患者血清瘦素水平增高、可溶性瘦素受体水平降低;曹瑛[13]研究糖尿病慢性溃疡中皮肤组织LeptinmRNA及OB-RLmRNA的基因表达水平均较正常皮肤组织减少可能是其愈合延迟原因之一。而在创伤中leptin和受体通过活化JAK/STAT通路等促进角化细胞增殖,因此可以参与创伤愈合[14]。在免疫方面,瘦素受体均可在T细胞和B细胞上表达,瘦素可刺激T细胞增生和Th1反应,抑制T细胞凋亡,并可诱导单核巨噬细胞分泌炎症细胞因子等参与免疫作用,因此在SLE、白塞病、银屑病等均参与发生发展[15]。因此瘦素不仅仅是一种能量调节因子,也可以通过自分泌或者旁分泌方式通过促进血管生成、调节炎症和免疫等影响皮肤衰老、创面愈合及毛囊的生长。

毛囊作为皮肤重要附属器官,具有周期性生长的特点:生长期、退行期、休止期,这种周期性的循环是由表皮细胞与真皮间充质细胞相互作用的结果,近年来研究发现脂肪细胞与毛囊细胞间通过生长信号相互交流,促进了毛发周期循环[6]。真皮脂肪层厚度变化与毛囊的自然再生发生了同步变化:在毛囊生长阶段,皮内脂肪细胞层扩张,而静止期脂肪层则变薄[16]。并且患有Goltz综合征或局部真皮发育不全的患者,皮肤脂肪组织发生变化,同时伴有稀疏的、脆弱的头发及局部脱发[17,18]。而缺乏皮肤脂肪组织或脂肪细胞功能障碍的小鼠表现出皮肤及毛发生长的缺陷[19,20]。在治疗方面,Fukuoka等[21]用培养脂肪干细胞(ADSCs)的培养基用于治疗脱发,可明显诱导头发生长。此外,在萎缩性瘢痕性脱发患者中,自体脂肪移植能够诱导眉毛再生,并在线形凹陷性萎缩性瘢痕和秃斑上取得显著的临床改善[22]。而David等[23]通过提取自体腹部脂肪,获取富含脂肪基质血管成分的细胞悬液后注射于雄激素性脱发患者头皮脱发区,可以明显促进毛发生长。这些脂肪细胞对毛囊的影响一部分可能与前体脂肪细胞分化增殖相关,另一方面可能由于脂肪细胞分泌脂肪因子通过自分泌或旁分泌方式调节毛囊生长发育[15]。其中最重要的两种脂肪因子为瘦素和脂联素(adiponectin)。己有研究证实了瘦素和瘦素受体在人体及小鼠皮肤角质形成细胞和成纤维细胞[24]、毛乳头细胞[4]、毛母质、内根鞘[25]等处均有表达,有学者研究发现脂联素可以通过促进毛发角质形成细胞增殖促进体外培养的毛囊的毛干生长,经脂联素处理的体外培养的毛乳头细胞胰岛素样生长因子(IGF)-1、肝细胞生长因子、血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)mRNA表达明显增加[26]。但瘦素对脱发性疾病的治疗作用研究报道仍较少。

本研究显示,局部注射瘦素可明显促进雄激素性脱发小鼠毛发生长,脱发面积明显减小,其治疗效果与外用米诺地尔相当,而HE染色提示瘦素组生长期毛囊/退行期毛囊比例明显增加,表明瘦素可诱导毛囊提前进入生长期或延长生长期。我们认为以上治疗效果可能与以下机制相关:(1)瘦素可通过激活JAK2-STAT3信号通路影响线粒体功能,増强线粒体活性,促进细胞代谢,改善及恢复皮肤的修复再生功能,诱导血管生成,促进创面愈合和毛发生长循环[27,28],我们实验中通过增殖及凋亡检测也表明瘦素和米诺地尔均可抑制凋亡,促进细胞增殖代谢;(2)在小鼠被皮中,瘦素受体在隆突部位上皮(K15阳性)处表达,且在静止期及生长期均有表达[6],隆突部位为毛囊干细胞所在位置,瘦素可能与局部受体结合后通过影响毛囊干细胞分化、增殖或迁移,从而激活毛囊再生长;(3)研究证实雄性激素受体(AR)表达增强的老鼠可通过阻止前脂肪细胞的分化[29]以及促进脂质合成[30]降低脂肪体积大小和重量,而我们研究中表明局部注射瘦素并不能抑制局部雄激素受体表达,但其是否与浓度相关还需要进一步探索;(4)瘦素诱导人角质形成细胞的STAT3信号通路通过影响角质形成细胞的分化、增殖、迁移等间接影响毛囊生长[31];另外也可通过调节其他细胞因子及激素水平等影响毛囊生长分化。这些机制与既往治疗雄激素性脱发机制有明显不同。

综上我们认为瘦素可治疗雄激素性脱发,且治疗效果及药物发挥作用与外用米诺地尔相当,且瘦素是一种人体自身分泌的多效能因子,对机体更安全有效,我们在背部局部注射瘦素过程中,小鼠背部皮肤无不良表现,小鼠未表现出消瘦、进食减弱、活动减少等情况,表明局部注射瘦素不足以影响小鼠全身激素代谢水平,而瘦素作用机制也许与诱导毛囊再生有明确相关性,这也许在维持雄激素性脱发治疗效果上能获得更为持久效果,因此调节自体瘦素分泌或外源性补充瘦素可能成为一种治疗雄激素性脱发的新的安全、简单、有效的方法。

参考文献：

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[12]毕桂姣.瘦素及其受体与天疱疮发病关系的研究[D].中国医科大学,2006.

[13]曹瑛.瘦素及其受体在糖尿病慢性皮肤溃疡组织中表达及临床意义的研究[D].南方医科大学,2007.

[28]林季,顾光涛.瘦素介导的细胞内信号途径在创面愈合中的作用[J].中国修复重建外科杂志,2007,21(11):1254-1258.

温旭红,张高峰,潘伦,刘官智.瘦素对雄激素性脱发小鼠模型毛囊的影响[J].中国麻风皮肤病杂志,2020,36(08):461-466.