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儿童炎症性肠病免疫机制中NLRP1、NLRP3炎性体信号通路的作用研究

2020-08-17 164 上传者：管理员

摘要：目的：探究核苷酸结合寡聚化结构域样受体-3(NLRP3)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体-1(NLRP1)炎性体信号通路在儿童炎症性肠病(IBD)免疫机制中的作用。方法：选取126例IBD患儿作为研究组,根据疾病类型分为克罗恩病(CD)(n=32)、溃疡性结肠炎(UC)(n=94)亚组；选取同期行结肠切除手术的结肠息肉/先天性巨结肠患儿120例作为对照组。比较各组肠黏膜NLRP3mRNA、NLRP1mRNA、Caspase-1mRNA、IL-1βmRNA表达情况。结果：研究组NLRP3mRNA、NLRP1mRNA、Caspase-1mRNA、IL-1βmRNA水平高于对照组,随CD、UC病情严重程度增加呈升高趋势(均P<0.05);UC、CD组患儿NLRP3mRNA、NLRP1mRNA、Caspase-1mRNA、IL-1βmRNA均与血清IgM、IgG呈正相关(均P<0.05),NLRP3mRNA、NLRP1mRNA均与Caspase-1mRNA、IL-1βmRNA呈正相关(均P<0.05)。结论：NLRP3、NLRP1炎性体信号通路可能通过上调Caspase-1、IL-1β表达参与儿童IBD的免疫机制调节。

关键词：
NLRP1
NLRP3
信号通路
炎性体
炎症性肠病
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炎症性肠病是一种慢性特发性肠病，主要包括克罗恩病、溃疡性结肠炎。数据统计显示，UC或CD发病率可达（344～758）/10万，尤其是伴有基础性自身免疫性疾病及免疫系统尚未发育完全的儿童人群发病风险更高[1,2]。同时，多项研究表明，IBD发病机制与机体免疫内环境改变直接相关[3,4]。故参与IBD免疫机制调节的信号通路已成为研究热点。有文献报道称，核苷酸结合寡聚化结构域样受体-1、核苷酸结合寡聚化结构域样受体-3可作为炎性体参与IBD发生、进展及免疫机制调节过程，从而影响肠道内环境和炎症的严重程度[5]。而Caspase-1、IL-1β是NLRP3、NLRP1炎性体信号通路的下游因子。为此，本研究推测NLRP3、NLRP1炎性体及其信号通路下游因子Caspase-1、IL-1β可能在儿童IBD免疫机制中发挥重要作用，但既往鲜有报道分析其在儿童IBD中的表达与免疫调节作用。故本研究选取126例IBD患儿进行分组研究，旨在为临床诊治提供参考依据。现报告如下。

1、资料与方法

1.1临床资料

选取我院2018年1月至2019年3月间IBD患儿126例作为研究组，其中男70例，女56例，年龄3～12岁，平均年龄6.0±1.4岁。根据疾病类型分为CD亚组（n=32）与UC亚组（n=94）。纳入标准：（1）经结肠内镜检查、实验室检查，并结合临床症状、体征确诊为儿童IBD;(2）符合《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见（2012年·广州）》中相关诊断标准[6];(3）临床资料完整，患儿监护人均知情本研究，自愿签订知情同意书。排除标准：（1）存在消化道肿瘤者；（2）伴有严重感染性疾病者；（3）合并严重营养不良者；（4）伴有内分泌疾病、代谢性疾病者；（5）存在恶性结、直肠疾病者；（6）合并心、肝、肾等重要脏器功能障碍者；（7）临床资料缺失者；（8）伴有消化道大出血者。

另选取同期因结肠息肉/先天性巨结肠行结肠切除手术的患儿120例作为对照组，其中男66例，女54例，年龄4～13岁，平均年龄6.2±1.2岁；85例为小结肠息肉，35例为先天性巨结肠。纳入标准：（1）患儿均具备手术指征；（2）临床资料完整者，且患儿监护人均知情本研究，自愿签订知情同意书。排除标准：（1）存在结肠感染者；（2）临床资料缺失者。

两组患儿年龄（t=0.906,P=0.366）、性别（χ2=0.008,P=0.930）差异无统计学意义。本研究经我院伦理委员会审批通过（2018090119）。

1.2实时逆转录-聚合酶链反应检测各mRNA

研究组在结肠内镜检查时采集患儿发病部位肠黏膜4g，对照组采集手术切除结肠组织断端正常肠黏膜4g。样本中加入组织裂解液，采用北京离心机厂的LDZ5-2型离心机进行离心处理，10000r/min、15min，于1mLTRIzol试剂裂解的样品中加入0.2mL氯仿，剧烈摇晃，持续30s，室温下放置3min，于4℃条件下进行离心处理，12000r/min、15min，提取RNA。加入等体积异丙醇，于-20℃条件下放置30min，弃上清液，加入1mL75%乙醇，振荡，加入DEPC水（20μL），室温下放置5min，待完全溶解后，加入5μL逆转录酶，室温下放置20min，置入37℃水浴锅内，孵育30min。于其底物中加入上下游引物（表1），进行实时逆转录-聚合酶链反应（rRT-PCR），实施琼脂糖凝胶电泳、上样，进行凝胶成像，采用凝胶图像分析软件定量，得出PCR产物的光密度值，以目的基因的光密度值表示其mRNA相对表达水平。

表1各基因引物序列

1.3血清IgM、IgG检测

采集清晨空腹静脉血3mL，离心处理，离心速度为2500r/min，持续15min，取上清液，保存于-20℃条件下待检。采用透射比浊法检测血清IgM、IgG水平，试剂盒及全自动生化分析仪购自美国R&D公司，所有操作步骤严格遵循试剂盒说明书。

1.4观察指标

记录（1）研究组和对照组NLRP3mRNA、NLRP1mRNA、Caspase-1mRNA、IL-1βmRNA的水平；（2)CD、UC亚组不同病情程度NLRP3mRNA、NLRP1mRNA、Caspase-1mRNA、IL-1βmRNA的水平；（3)CD、UC亚组不同病情程度血清IgM、IgG水平。

采用CD活动指数（CDAI）评估CD患儿病情严重程度：<150分为缓解期，150～220分为轻度活动，221～450分为中度活动，>450分为重度活动[7]。采用改良Mayo评分系统评估UC患儿病情严重程度：≤2分为缓解期，3～5分为轻度活动，6～10分为中度活动，11～12分为重度活动[8]。

1.5统计学分析

采用SPSS22.0软件进行统计学分析。正态分布计量资料采用均数±标准差表示，两组间比较采用两样本t检验，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。计数资料采用率或构成比（%）表示，组间比较采用χ2检验。符合正态分布且方差齐的计量资料相关性分析采用Pearson相关。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1研究组与对照组各mRNA水平比较

研究组NLRP3mRNA、NLRP1mRNA、Caspase-1mRNA、IL-1βmRNA水平高于对照组（P<0.05），见表1。

2.2CD、UC亚组不同病情程度各mRNA水平比较

NLRP3mRNA、NLRP1mRNA、Caspase-1mRNA、IL-1βmRNA水平随CD、UC病情严重程度增加呈升高趋势（P<0.05），见表2～3。

表1研究组与对照组各mRNA水平比较

表2CD亚组不同病情程度各mRNA水平比较

表3UC亚组不同病情程度各mRNA水平比较

2.3CD、UC亚组不同病情程度IgM、IgG比较

血清IgM、IgG水平随CD、UC病情程度增加呈逐渐升高趋势（P<0.05），见表4～5。

表4CD亚组不同病情程度IgM、IgG水平比较

表5UC亚组不同病情程度IgM、IgG水平比较

2.4各mRNA与IgM、IgG的相关性

UC、CD患儿NLRP3mRNA、NLRP1mRNA、Caspase-1mRNA、IL-1βmRNA均与血清IgM、IgG呈正相关（P<0.05），见表6。

表6各mRNA与免疫抗体的相关性

2.5NLRP3mRNA、NLRP1mRNA与Caspase-1mRNA、IL-1βmRNA的相关性

NLRP3mRNA、NLRP1mRNA均与Caspase-1mRNA、IL-1βmRNA呈正相关（P<0.05），见表7。

表7NLRP3mRNA、NLRP1mRNA与Caspase-1mRNA、IL-1βmRNA的相关性

3、讨论

流行病学调查显示，IBD已逐渐成为全球范围内重要公共卫生问题，明显增加全球负担，防治形势极为严峻[9]。目前，儿童IBD发病机制尚未完全清楚，普遍认为主要与变态反应、遗传倾向性、环境、免疫应答失调、自身免疫性疾病等多种因素密切相关[10]。有学者认为，免疫机制紊乱在CD、UC等IBD发生、进展中占主要地位[11]。因此，明确IBD免疫机制相关信号通路的调节作用成为临床重要的研究方向。

NLRP3、NLRP1属于核苷酸调节因子成员，主要通过调节肠道上皮细胞的自身性核苷酸代谢，促进炎症反应，还可增加T淋巴细胞毒性，促使自然杀伤性T淋巴细胞浸润，导致病情恶化。临床研究显示，NLRP3、NLRP1炎性体过度活化可引发自身炎症性疾病和自身免疫性疾病[12]。张目涵等[13]研究显示，NLRP3、NLRP1参与IBD疾病发生、病情进展过程，可能与炎症的严重程度有关。本研究发现，与正常肠黏膜相比，IBD患儿肠黏膜NLRP3mRNA、NLRP1mRNA水平明显升高，提示NLRP3、NLRP1可能参与儿童IBD的发病，与上述研究结果相符[13]。NLRP3、NLRP1可作为机体固有免疫感受器参与固有免疫应答，异常表达可引发免疫紊乱，还能改变肠道微生态菌群，促进炎性因子释放，减弱肠道微生物固有免疫应答，从而引发IBD。同时，有文献指出，NLRP3基因突变可增加IBD易感性，其炎性体在UC、CD等不同类型IBD发病中均具有重要作用[14]。说明其基因表达升高可促使CD、UC病情程度加重。因此，检测肠黏膜NLRP3mRNA、NLRP1mRNA可能成为临床诊治新途径。

NLRP3、NLRP1炎性体属于Th1适应性免疫应答的重要组成部分，其中NLRP3炎性体主要聚集于CD4+T细胞中，被激活后可启动Caspase-1依赖的IL-1β分泌，并以自分泌途径加快γ-干扰素产生，促进Th1分化，引发免疫失衡[15]。肠黏膜Caspase-1mRNA、IL-1mRNA水平在IBD患者中呈异常升高表达[16]。本研究发现，Caspase-1mRNA、IL-1βmRNA不仅显著升高，还与UC、CD病情严重程度密切相关，可见Caspase-1、IL-1β以过表达方式参与儿童IBD的发生发展。在机体慢性炎症阶段，NLRP3、NLRP1炎性体长时间处于被过度激活状态，不断转化为有活性的Caspase-1，促进固有层巨噬细胞、树突状细胞释放IL-18、IL-1β，而IL-18、IL-1β释放后可诱导T细胞分化为致病性Th1、Th17表型，从而导致炎症反应发生并维持，进而参与IBD发生进展过程[17]。同时，Caspase-1作为炎性体因子成员，可促进凋亡蛋白、凋亡因子损伤巨噬细胞或单核细胞，还能增加氧化应激损伤，加快UC、CD患儿发生持续性黏膜柱状上皮细胞凋亡，导致病情恶化。此外，研究表明，NLRP3炎性体激活后可迅速产生IL-1β，IL-1β作为炎症主要调节因子之一，过表达可造成Th17/Treg失衡，而Th17细胞、Treg细胞是调节肠道免疫反应、炎症反应的重要机制[18]。故NLRP3、NLRP1炎性体信号通路可能通过上调其相关因子Caspase-1、IL-1β表达参与儿童IBD免疫机制调节过程，从而对疾病进展产生影响。抑制Caspase-1、IL-1β表达可能成为减轻IBD患儿炎症反应、调节免疫紊乱的重要环节。

免疫抗体在IBD免疫紊乱过程中发挥重要作用。本研究发现，血清IgM、IgG水平随CD、UC病情严重程度增加呈逐渐升高趋势，提示IgM、IgG参与CD、UC病情进展，可能与两者异常表达导致免疫失衡，加剧炎症反应有关。同时，本研究首次尝试分析NLRP3、NLRP1炎性体及相关因子与免疫抗体的关系，结果显示，UC、CD患儿NLRP3mRNA、NLRP1mRNA、Caspase-1mRNA、IL-1βmRNA与血清IgM、IgG均呈正相关，说明NLRP3、NLRP1炎性体及相关因子可能通过上调IgM、IgG表达调节IBD患儿免疫机制。此外，本研究进一步显示，NLRP3mRNA、NLRP1mRNA与Caspase-1mRNA、IL-1βmRNA均呈正相关。提示NLRP3、NLRP1与Caspase-1、IL-1β密切相关，调节此信号通路对治疗IBD患儿具有重要意义。但本研究未详细探讨IBD患儿治疗前后NLRP3、NLRP1炎性体及相关因子变化趋势及其对免疫调节、病情改善的影响，需作进一步分析与探究。

综上可知，NLRP3、NLRP1炎性体信号通路可能通过上调IgM、IgG、Caspase-1、IL-1β表达参与儿童IBD免疫机制调节过程，且与疾病发生、病情严重程度密切相关，有助于为临床诊治提供更多参考依据。

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