CLCN2基因是编码氯离子通道2(ClC-2）蛋白的基因。ClC-2在人体中分布广泛，尤其在大脑中表达较高，其在调节水电解质平衡中发挥重要作用。CLCN2相关白质脑病（CC2L）是由CLCN2基因突变进而导致ClC-2功能障碍而引起的常染色体隐性遗传病。CC2L患者常表现为视网膜脉络膜病变或视神经萎缩、男性不育、小脑性共济失调、认知障碍、学习障碍等，颅脑MRI常提示髓鞘空泡变性[1]。关于CC2L，仅有少量的病例报道，且由于尚无合适的疾病模型，其致病机制尚不明确，目前也无有效的治疗手段。因此，创建用于研究CLCN2基因相关疾病的体外细胞模型很有必要。

随着体细胞重编程技术的发展，获取患者特异的诱导多能干细胞（iPSC）成为现实[2]。研究表明，iPSC具有向机体几乎所有细胞分化的能力，不仅可构建多种体外细胞模型进行疾病机制的研究以及药物筛查，还可用于替代移植治疗[3,4]。本课题组旨在建立CLCN2突变患者特异iPSC系（CC2L-iPSC），为CLCN2突变相关疾病的发病机制及治疗提供研究基础。

材料与方法

一、标本来源

采集1例就诊于中山大学附属第三医院神经内科的38岁女性患者的尿液。该例患者表现为双手的意向性震颤、记忆减退、耳鸣及视力减退；体格检查提示小脑性共济失调；大脑MRI提示内囊、大脑脚和小脑中脚的白质出现异常的T1加权像低信号、T2加权像高信号，随后的Sanger测序证实其CLCN2基因有1个纯合致病突变（Exon20:c.2257C>T;p.Arg753Ter），其符合CC2L的诊断标准[5]。本实验征得患者同意并签署知情同意书，而且经中山大学附属第三医院伦理委员会批准。

二、细胞、质粒和主要试剂

1.细胞和质粒

正常人IPSC系UE017及质粒pCEP4-miR-302-367 cluster均由中国科学院广州生物医药与健康研究院潘光锦研究组馈赠；pEP4-EO2S-ET2K购自美国Addgene。

2.主要培养基配方

尿液细胞培养液——由DMEM/Ham’s:F12 1:1(Life Technologies）、10%胎牛血清（Gibco）、0.1mmol/L非必需氨基酸（Gibco）、1 mmol/L Gluta MaxTM-1(Gibco）、0.1 mmol/Lβ-Mercaptoethanol(Gibco）和0.1 mmol/L Renal Cell Growth Medium(Lonza）、0.1 mmol/L Single Quotkit supplements(Lonza）、0.1 mmol/L penicillin/streptomycin(Gibco）配成；神经诱导培养基（Gibco）；增殖培养基——由Neurobasal Medium(Gibco）、Advanced DMEM/F-12(Gibco）和Neural Induction Supplement(Gibco）按49∶49∶2配成；星形胶质细胞分化培养基——由DMEM(Gibco）、1x N2和1%胎牛血清（Natocor）配成。

3.其它主要试剂

L-gelatin基质胶（Millipore);EDTA-胰蛋白酶（trypsin-EDTA,Gibco);NucleofectorTM Kit for primary mammalian epithelial cell试剂盒（Lonza);Matrigel胚胎干细胞基质胶（Cornning);mTeSR1TM培养液（Stem Cell Technologies);EDTA(Invitrogen);Accutase(Invitrogen);Prime ScriptTM RT Master Mix试剂盒（Takara);SYBR Premix EX Taq试剂盒（Takara）；瑞氏-姬姆萨染色液（贝索生物）；BCIP/NBT、碱性磷酸酯酶显色试剂盒（碧云天生物）。引物均由英潍捷基（上海）公司合成，具体序列见表1。免疫荧光所用抗体信息见表2。

三、方法

1.尿液细胞的收集、扩增培养

采集CLCN2突变患者清洁中段尿500 ml，室温下×400 g离心10 min后弃掉上清液。离心后的尿液细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后加入2 ml尿液细胞培养液重悬。重悬后的细胞转移至L-gelatin包被并加有每孔2 ml尿液细胞培养液的六孔板中，置于恒温箱中培养。5 d后，当细胞群融合时，用0.25%trypsin-EDTA消化，并按1∶3传代。

2.尿液细胞的重编程

根据文献[6]的方法进行操作，尿液细胞扩增至约1.5×106个/孔后，按NucleofectorTM Kit for primary mammalian epithelial cell试剂盒的说明往尿液细胞中加入电转缓冲液，并加入6μg pEP4-EO2S-ET2K质粒以及4μg pCEP4-mi R-302-367 cluster质粒，通过Amaxa电转仪进行电转染（程序：T-020,Lonza）。转染后的细胞按2×105个/孔接种于Matrigel包被的六孔板中，加入尿液细胞培养液培养2 d后，换mTeSR1TM培养液于恒温箱中（37℃，5%CO2）继续培养，隔日换液。电转染18 d后，挑取生长状况良好且具有清晰边界的克隆，转移至新的Matrigel包被的六孔板中，加入mTeSR1TM培养液继续培养。当细胞融合度达到80%时，用0.5mmol/L EDTA消化，并按1∶3～1∶6进行传代。

3.iPSC向星形胶质细胞定向分化能力鉴定

采用文献[7]的诱导方案，iPSC传代后第2日，换神经诱导培养基，每日换液，7 d得到原始神经干细胞（NSC）。加入Accutase细胞消化液把原始NSC消化为单细胞，按5×105个/孔接种于Matrigel包被的六孔板中，加入神经增殖培养基扩增培养，隔日换液，培养5～7 d后得到成熟NSC，此时可传代或进行后续分化操作。进行星形胶质细胞分化时，把Accutase消化后的NSC按5×105个/孔接种于Matrigel包被的六孔板中，加入星形胶质细胞分化培养基，隔日换液，当细胞融合度达到80%时（5～7 d）用Accutase消化并按1∶4进行传代，培养约25 d。

表1引物序列

表2抗体信息 

4.核型鉴定

i PSC传代6次后，融合度达到80%时，用0.2μg/ml秋水仙碱在室温中处理细胞2 h，然后加入0.5 mmol/L EDTA消化并收集细胞，加入0.075 mol/L KCl溶液于37℃中处理20 min，然后用卡诺氏固定液（乙酸∶乙醇为1∶3)1 ml，在37℃中固定40 min。200 r/min离心5 min，加入1 ml卡诺式固定液重悬，吸取悬液滴在一干净的载玻片上，然后置于75℃烘箱中3 h。最后，滴加5%的Giemsa染液染色20 min，自然晾干后在Olympus显微镜下进行标准G带核型分析。

5.基因突变分析

收集2×106 iPSC送往广州金域医学公司进行Sanger测序，并根据检测结果用Swiss模型预测iPSC的ClC-2蛋白的三级结构[11]。

6.免疫荧光染色

当生长在爬片上的iPSC、NSC和星形胶质细胞融合度达60%时，进行免疫荧光染色，操作步骤如下，加入4%多聚甲醛固定15 min，用PBS清洗3遍，加入封闭破膜液（10%驴血清/0.25%Triton X-100溶液1∶9）后于室温中静置1 h。吸走封闭破膜液，加入一抗，在4℃中孵育过夜（>22h）。吸走一抗，用PBS清洗3遍，避光中加入相应的二抗，避光孵育1 h。吸走二抗，用PBS洗涤2遍后加入DAPI溶液，避光静置15 min，用PBS洗涤3遍后滴加抗荧光淬灭剂，置于荧光显微镜下观察并拍照。

7.逆转录PCT(RT-PCR）检测iPSC多能干性的表达及重编程因子的清除

iPSC传代9次后，使用Trizol提取总RNA，按照Prime ScriptTM RT Master Mix的说明逆转录c DNA,PCR循环参数为：95℃预变性2 min;95℃，30 s,35个循环；60℃，30 s;72℃，30 s;72℃，8 min。PCR结束后，取10μl扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳时间30 min。

8.实时荧光定量PCT(qRT-PCR）检测NSC和星形胶质细胞各基因的表达

使用SYBR Premix EX Taq试剂盒进行qRT-PCR，扩增神经干细胞相关基因PAX6、Nestin、SOX2及星形胶质细胞相关基因S100β、GFAP。GAPDH作为内参照。引物序列见表1。

9.体内畸胎瘤形成实验

收集CC2L-iPSC，加入mTeSR1溶液制成细胞悬液，与等量50X Matrigel混合后，分别注射到9只6周龄免疫缺陷的NOD-SCID小鼠（购于中山大学中山眼科中心动物实验中心）中，每只小鼠注射双后肢及后背共3个位点，每个位点注射200μl细胞悬液（含1.5×106 iPSC）。每3日观察并记录小鼠情况直至畸胎瘤形成。处死小鼠并切除畸胎瘤组织，把畸胎瘤用甲醛固定、石蜡包埋后切片，并用HE染色，最后在显微镜下观察不同类型组织结构并拍照。

结果

一、CLCN2患者尿液细胞重编程为iPSC

收集CLCN2突变患者约500 ml清洁中段尿，离心后得到的尿液细胞经扩增后在光镜下呈正常的细胞形态，主要有2种细胞类型，1型细胞较小，呈纺锤状，大小基本一致，数量较多；2型细胞较大，呈均质圆形，数量较少且繁殖能力较低（图1B-a、b）。

通过非整合重编程的方法（图1A），把携带OCT4、SOX2、KLF4、SV40LT转录因子的ORIP/EBNA1附着体和miR-302-367 cluster经电转染导入尿液细胞，9 d后，镜下可见部分尿液细胞发生形态改变，呈不规则扁平状聚集（图1B-d）。18 d后得到高核质比、轮廓清晰、中心紧凑的i PSC克隆（图1B-f）。把目标克隆挑取再培养15 d后可得到细胞形态均一、高核质比的iPSC克隆（图1C），这些克隆可进行稳定传代，核型鉴定结果正常（图1D）。本研究最终共获取5个iPSC克隆，并对其中3个克隆（C4、C12、C13）进行了充分的验证。

二、CC2L-iPSC表达多能性标记，不含外源因子及整合基因，在体内可形成畸胎瘤

在至少传代12次后，对CC2L-i PSC进行RT-PCR，结果表明所有外源重编程因子（OCT4、SOX2、KLF4、SVL40T和mi R-302-367）和游离质粒DNA(ORIP和EBNA-1）均呈阴性（图2A）。CC2L-i PSC克隆均表达包括OCT4、SOX2、NANOG、GDF3和DNMT3B在内的干细胞多能性基因（图2B）。免疫荧光染色还证实，已建立的CC2L-i PSC表达典型的多能性蛋白标记物SSEA4、NANOG、OCT4和TRA-1-60（图2C）。把CC2L-i PSC注射到小鼠体内8周后，可得到畸胎瘤，经HE染色可见三胚层结构，分别是包括内胚层的肠上皮、中胚层的软骨、外胚层的神经组织（图2D）。

三、CC2L-i PSC包含纯合的CLCN2突变

与NCBI基因数据库中的CLCN2基因序列对比（图3A),Sanger测序证实CC2L-i PSC包含纯合突变c.2257C>T(p.Arg753Ter）（图3B），与患者血液的Sanger测序结果一致。基于已确认的氯离子通道1(ClC-1）结构，本研究通过SWISS-MODEL对ClC-2蛋白的三级结构进行预测，预测模型表明ClC-2为同源二聚体，c.2257C>T突变导致蛋白C端截短（图3C）。

图1尿液细胞重编程为iPSC

四、CC2L-iPSC能够向神经方向分化，形成星形胶质细胞

加入神经诱导培养基后，iPSC无需通过形成神经花环即可直接分化为NSC（图4A）。在诱导分化过程中，细胞呈单层扁平状集落样增殖，且体积略变小，呈均一圆球状，细胞透亮度增加（图4B-a）。消化后重新接种的NSC呈链状分布（图4B-b），单个细胞呈扁平不规则多边形，细胞体积增大（图4B-c）。加入星形胶质细胞培养基后，单个细胞进一步呈不规则多角形，细胞体积进一步增大，胞质淡染（图4B-d）；随着传代次数的增加，细胞胞质逐渐明显、边界逐渐锐利清晰（图4B-e～f）我们以健康人尿源iPSC系UE017进行同样诱导分化操作，把所得到的NSC和星形胶质细胞作为对照组，与CC2L-iPSC C4和C12 2个细胞系的分化所得细胞进行qRT-PCR，结果表明所得到的NSC(P2代）表达PAX6、SOX2和NESTIN神经干细胞相关基因；所得到的星形胶质细胞（25d）表达GFAP和S100β，且它们的表达量均与健康对照组相近（图4C）。对P2代NSC进行免疫荧光染色，可见Nestin和PAX6均呈阳性（图4D);25 d的星形胶质细胞免疫荧光结果显示其表达胶质细胞特异性分子标志GFAP、S100β和VIMENTIN（图4E）。

图2 CC2L-iPSC多能性检测

图3 CC2L-iPSC突变分析

讨论

ClC-2在人体中广泛表达，研究表明CLCN2基因突变与生殖系统疾病、消化系统疾病、呼吸系统疾病以及神经系统疾病等均有关，但是，其具体机制尚不清楚[8,9,10,11,12]。由于iPSC能够自我更新并分化为人体中绝大多数类型的细胞和组织，因此其已成为研究发育和疾病（尤其是遗传性疾病）的重要材料。本课题组采用无创且非整合的方法首次成功构建CLCN2突变患者特异性iPSC，并对其进行充分的验证，确认它们来源于CLCN2突变患者尿液细胞，具有正常的核型，并证实其具有典型的iPSC特征，包括表达多能性基因和多潜能分化能力等。这些包含CLCN2遗传背景的iPSC可以作为体外细胞模型用于进一步的研究，以揭示ClC-2功能障碍对各个器官、系统的影响。

CC2L是一种罕见的常染色体隐性遗传疾病，是由于CLCN2基因突变致ClC-2氯化物通道蛋白功能异常引起的，其与大脑中水电解质平衡有关。在中枢神经系统中，ClC-2主要分布在少突胶质细胞周围的缝隙连接处以及血管周围基底的星形胶质细胞末端。有学者认为，ClC-2在神经活动后会通过星形胶质细胞合胞体重吸收Cl-以维持神经元的兴奋性[13]。CLCN2的突变可能影响ClC-2通道对Cl-的通透性而导致其重吸收功能障碍，这可能解释了CC2L的发病机制[11]。另一项基于果蝇的研究表明，ClC-2通道在神经系统发育中起着重要作用，因为它们参与控制神经胶质和神经元的发育形成以及两者的连接，这也可能与CC2L有关[14]。然而，CLCN2基因突变疾病的确切分子机制仍然有待进一步阐明。虽然CLCN2基因敲除（K/O）小鼠模型已被成功构建，但这些小鼠并不能真实反映CC2L的遗传背景。本研究预测突变后的ClC-2的三级结构仅显示其C端截短了，表明它可能保留部分功能，正如一些研究者指出，在CC2L患者中ClC-2的功能并不完全丢失，相反，K/O小鼠中的ClC-2功能明显受损。因此，构建一个能更真实反映CC2L的疾病模型非常必要。本课题组和其他研究者的研究表明，人类iPSC可以成功地分化为神经细胞和组织，包括大脑和3D视网膜等，这些研究可为建立合适的CC2L疾病特异性细胞模型提供基础，以进一步探究其发病机制及进行药物筛查。此外，这些患者的iPSC还可在通过基因编辑技术进行突变校正后为细胞治疗提供细胞来源。

图4 CC2L-iPSC向星形胶质细胞定向诱导分化及CC2L-iPSC定向分化后免疫荧光鉴定

皮肤成纤维细胞和血液细胞、肝细胞、羊水细胞等已被广泛用作构建i PSC的亲代细胞，但它们是通过侵袭性方式采集获得的[2]。相比之下，本研究通过无创尿液收集的方式获得的细胞来源，取材方便，更易被患者接受。同时，有研究表明尿路上皮细胞较皮肤成纤维上皮更具有上皮的特性，其重编程效率比血液细胞和皮肤成纤维细胞更为高效[6]。此外，整合基因组的病毒感染方法会使外源基因随机但永久地整合到宿主基因组中而带来潜在的风险，如产生插入突变、影响分化潜能导致肿瘤发生等。相比之下，本研究采用非整合方法，pEP4-E02S-ET2K质粒含有的ORIP/EBNA1元件可以使其携带的OCT4、SOX2、KLF4和SV40LT以游离体的形式稳定存在，并有利于游离基因组的核转移。pEP4-E02S-ET2K质粒的复制周期与供体细胞基本相同，因此在重编程过程中，随着细胞的增殖，其能不断表达转录因子。当iPSC形成后，因为i PSC的增殖速度较供体细胞和质粒更快，质粒因复制不同步便会随着iPSC的增殖而逐渐丢失，得到的iPSC细胞一般在经过5～10代的培养后就没有附加载体质粒的存在了，此方法较之传统的整合方法更为安全且更适用于临床。

为了验证此白质脑病患者来源的iPSC能否进行神经分化，我们采用成熟的单层贴壁神经定向诱导分化方案，把其向神经方向定向诱导分化。结果表明本研究所构建的CC2L-iPSC可以正常分化为神经干细胞和星形胶质细胞，初步的分化结果显示其各项细胞相关基因的表达与正常细胞大体相当，这表明CC2L-iPSC可被用于构建白质脑病的体外细胞模型。综上所述，本课题组建立了一个将尿液细胞通过非整合的方法诱导为iPSC的方案，有望被用于CLCN2基因突变的致病机制和治疗等研究。然而，在目前已报道的CC2L病例中，存在不同的CLCN2基因突变类型，本课题组仅构建了携带其中一种突变类型的iPSC细胞系，也只是初步鉴定了所获得的CC2L患者来源细胞的iPSC重编程及星形胶质细胞分化能力，没有对重编程效率以及CC2L发病机制进行探讨。接下来我们希望能发掘更多CC2L病例，或通过基因编辑技术等构建不同突变类型的iPSC，扩大样本量，建立CC2L患者特异性的iPSC细胞库，为今后深入研究CC2L发病机制及治疗方法提供便利。

参考文献：

[3]邢红艳,张艺哲,王美婷,赵琪,汪溪洁.人诱导多能干细胞分化的心肌细胞在疾病模型和药物筛选中的应用.中国医药工业杂志,2019,50(8):834-841.

陈灼林,刘佳,谢冰冰,甘周庆,钟秀风,彭福华.CLCN2基因突变者尿液来源诱导多能干细胞的构建及定向分化神经细胞[J].新医学,2020,51(08):581-589.

基金:广东省精准医学与干细胞重大专项(2017B020230003)