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过表达铁蛋白重链的间充质干细胞进行体外MRI的可行性实验研究

2020-08-17 241 上传者：管理员

摘要：目的探讨过表达铁蛋白重链(FTH)的间充质干细胞(UE7T-13)进行体外MRI的可行性，并验证温敏性水凝胶HA-F127复合UE7T-13是否可抑制其凋亡、促进细胞因子分泌。方法构建携带FTH-绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒载体并感染UE7T-13，检测感染后的GFP阳性率及FTH表达水平。同时，HA-F127复合FTH/UE7T-13，细胞计数试剂盒(CCK8法)检测FTH慢病毒载体感染后和(或)水凝胶复合后的UE7T-13细胞增殖能力，并进行HA-F127复合FTH/UE7T-13的MRI。检测HA-F127复合对过氧化氢(H2O2)诱导UE7T-13细胞凋亡的影响，ELISA检测IL-10、HGF含量。结果FTH-GFP慢病毒载体可成功感染UE7T-13,48h荧光显微镜观察GFP表达率几乎100%,FTHmRNA表达提高了3倍，FTH蛋白可随着时间延长表达增多并至5d仍稳定高效表达。FTH感染或HA-F127复合均不影响UE7T-13增殖能力，不影响骨髓间充质干细胞的体外MRI。HA-F127复合UE7T-13可抑制H2O2介导的细胞凋亡，并促进IL-10、HGF细胞因子分泌。结论过表达FTH实现UE7T-13的MRI示踪功能，温敏性水凝胶HA-F127可在过氧化损伤环境下抑制FTH/UE7T-13的凋亡，并促进其分泌IL-10、HGF，可为下一步实验奠定基础。

关键词：
凋亡
水凝胶
磁共振成像
铁蛋白重链
骨髓间充质干细胞
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我国慢性乙型肝炎患者约2000万，每年死于肝纤维化和肝癌的患者高达50万，是全球晚期肝病发病率最高的地区[1]。目前尚无有效治疗肝纤维化的临床方法，间充质干细胞（MSC）被认为具有修复肝纤维化的潜能[2]。前期实验表明，体内微环境影响MSC存活率，并且缺乏活体监测MSC的有效手段是阻碍MSC治疗从基础研究向临床移植治疗转化的关键[3,4]。本研究拟构建可活体MRI显像的过表达铁蛋白重链（FTH）的MSC(FTH/MSC），并体外证实其可实现MSC的MRI示踪功能，同时，通过构建功能化水凝胶（HA-F127）改善细胞外微环境，以提高MSC的存活率及旁分泌功能，为下一步实验奠定基础。

材料与方法

一、主要试剂和仪器

DMEM-LG培养基（GIBCO),FTH基因质粒（广州永诺生物科技有限公司），CCK-8细胞计数试剂盒（日本同仁化学研究所），HGF、IL-10ELISA试剂盒（RD公司），兔抗人FTH单克隆抗体、兔抗人GAPDH单克隆抗体（武汉博士德公司）。荧光显微镜（奥特BDS200-FL），酶标仪（Diatek公司），冷冻高速离心机（HemaTGL-16R),1.5T磁共振成像仪（SignaInfinity Twinspeed,GE公司）。人永生化骨髓MSCUE7T-13（日本Mori等[5]惠赠）：5%二氧化碳（CO2),37℃环境下，低糖DMEM培养基（含10%胎牛血清）培养（图1）。

二、慢病毒载体构建、病毒感染及基因表达检测

通过PCR进行FTH基因和IRES-绿色荧光蛋白（GFP）基因扩增，将二者连接后，与慢病毒载体LV003相连，构建LV003-FTH-IRES-GFP慢病毒载体进行测序鉴定；同时构建GFP慢病毒载体作为阴性对照（FTH/UE7T-13及GFP/UE7T-13）。采用脂质体法将重组载体感染人胚肾细胞293A(HEK-293A）进行包装，检测病毒滴度（TU/ml）。

将5×105UE7T-13接种至6孔板，感染前更换新鲜培养液，根据预实验获得的最佳感染复数（3000pfu/细胞）加入病毒液，混匀后置于细胞培养；于6h更换新鲜培养液，每隔24h观察细胞状态。

图1显微镜下UE7T-13细胞形态

病毒感染后48h，采用荧光显微镜观察GFP表达情况；定量PCR(Q-PCR）方法检测FTHmRNA水平，引物如下（FTH1-F:GACTCAGAGGCCGCCATCAA;FTH1-R:AAGATTCGGCCACCTCGTTG），使用2-ΔΔCt法[ΔCt=Ct(FTH)-Ct(GAPDH），△△Ct=Ct(FTH/UE7T-13)-Ct(UE7T-13）]；采用蛋白免疫印迹法检测FTH慢病毒感染UE7T-13后1、2、3、5d的FTH蛋白表达。

三、体外细胞MRI

分别将不同数量（1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108)FTH/UE7T-13细胞进行体外MRI扫描。扫描方案：1.5TMR，并采用内径12.7cm的表面线圈，进行SE序列T2W扫描，参数：重复时间=400ms，回波时间=100ms，带宽20.83,NEX=2.0,FOV=20cm×20cm，层厚2mm，矩阵384×256。

四、温敏水凝胶透明质酸（HA)-F127的制备、鉴定并复合FTH/UE7T-13

称取0.9g的普朗尼克（Pluronic)F127分别和0.05、0.1、0.15、0.2、0.25g透明质酸钠混合，配制成质量分数为18%及分别含有不同浓度（1%、2%、2.3%、2.5%、3%、4%、5%)HA-F127溶液，使其可在37℃凝胶，成胶后采用扫描电镜观察凝胶（HA-F127）的三维结构。

收集生长状态良好的第3～5代慢病毒感染后UE7T-13，消化、离心后，用未凝固的水凝胶混合液重悬细胞沉淀，UE7T-13与HA-F127充分混合后，置于5%CO2、37℃细胞培养箱内，待凝固成胶体后，每孔再添加200μl含10%胎牛血清和1%链霉素的DMEM细胞培养基。

细胞实验根据处理情况共分4组：A组（UE7T-13），未感染的UE7T-13;B组（GFP/UE7T-13），空白载体载GFP感染的UE7T-13;C组（FTH/UE7T-13),FTH慢病毒感染的UE7T-13;D组（GEL-FTH/UE7T-13),HA-F127复合的FTH/UE7T-13，即凝胶组。

五、HA-F127复合及FTH感染对UE7T-13的成脂成骨分化能力检测

D组（GEL-FTH/UE7T-13）需先放入4℃冰箱中溶解凝胶，凝胶溶解后去除，并使用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）进行清洗，分别向培养板内加入成脂、成骨诱导分化培养基，分别采用油红O染色、茜素红染色，显微镜下观察标记后MSC的成脂、成骨分化情况。

六、CCK-8检测HA-F127复合FTH/UE7T-13的增殖率

4个处理组各取5×103个细胞，均匀接种于96孔板，于接种后第3日进行CCK-8，检测细胞增殖情况，以A组（UE7T-13）作为对照组，每次每组设3个复孔，取平均值。

七、HA-F127复合FTH/UE7T-13抗过氧化氢（H2O2）诱导细胞凋亡及促进细胞因子释放的检测

将C、D组细胞接种于6孔板，24h后加入H2O2(50μmol/L），调整终浓度为50μmol/L，继续培养12h；培养结束后，收集细胞进行流式凋亡检测。采用ELISA检测C组及D组上清液的肝细胞生长因子（HGF）、IL-10浓度：分别将2组5×105个细胞接种于6孔板，24h后加入H2O2(50μmol/L），继续培养12h，取细胞上清液检测HGF、IL-10水平。

八、统计学处理

采用SPSS19.0进行统计分析，数据以表示。两独立样本采用t检验进行组间比较。多组比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、成功构建LV003-FTH-IRES-GFP慢病毒载体并转染UE7T-13

LV003-FTH-IRES-GFP慢病毒载体，并成功感染UE7T-13。感染293A48h后，细胞免疫法检测病毒滴度为1×109TU/ml。FTH慢病毒感染UE7T-1348h后荧光显微镜下观察，GFP表达阳性率几乎100%（图2A);Q-PCR证实FTH慢病毒感染UE7T-1348h后FTHmRNA表达水平提高了3倍（P<0.001);FTH慢病毒感染UE7T-13,FTH蛋白表达随着感染时间延长增多。

图2FTH慢病毒感染UE7T-13后FTH表达的检测

二、HA-F127可成功复合MSC，不影响细胞增殖能力

当F127浓度为18%,HA浓度为2.3%,HA-F127可在37℃凝固成胶（图3A）。CCK-8显示，4组细胞生长增殖情况比较差异无统计学意义（P=0.809，图3B）。HA质量分数与凝胶化温度的关系见表1。

表1HA浓度与凝胶化温度的关系

图3F127温敏性水凝胶成胶及对细胞增殖活性影响

三、HA-F127复合FTH/UE7T-13的MRI

HA-F127复合FTH/UE7T-13后，利用FTH的T2负性对比效应，可检测MSC的T2负性对比，在磁共振T2加权图像上呈低信号。并且随着细胞数量的增加，MRI标准化信号强度逐渐降低（图4）。

图4FTH/UE7T-13MRI

四、HA-F127复合FTH/UE7T-13不影响其成骨成脂分化能力

水凝胶包裹FTH/UE7T-13洗脱后进行成骨成脂诱导：(1)茜素红染色显示FTH/UE7T-13大片深红色化合物，聚集部可见斑片状橘红色钙盐沉积（图5A);(2)油红O染色显示FTH/UE7T-13体积增大，胞浆内可见串珠状红色脂滴（图5B）。上述证明成骨成脂诱导成功。

五、HA-F127复合可抑制UE7T-13凋亡，并促进HGF及IL-10的旁分泌

经H2O2处理12h后，D组细胞早期凋亡率为5.7%，晚期凋亡率为13.9%,C组细胞早期凋亡率为7.2%，晚期凋亡率为21.7%,D组细胞凋亡数量少于C组（图6A）。ELISA实验证实，D组的上清液中HGF及IL-10分泌较C组增加（HGF:148.4±15.9vs.42.9±3.9,t=-11.1,P<0.001;IL-10:49.51±5.4vs.21.2±2.6,t=-5.7,P=0.005；图6B）。

讨论

干细胞移植治疗终末期肝病越来越受到人们的关注[2]。然而，仍有研究指出MSC移植不能改善，甚至是促进肝纤维化，可能是肝纤维化体内微环境导致MSC活性降低或者死亡[6,7]。因此，如何改善移植后微环境，提高MSC存活率及增强旁分泌能力，可能是提高MSC移植治疗肝纤维化疗效的关键。因此本研究采用HA-F127复合MSC改善细胞生长微环境，增强MSC在H2O2过氧化损伤环境中的存活及旁分泌功能；同时，通过MRI分子影像技术，实现MSC的活体示踪的目的。

图5HA-F127复合FTH/UE7T-13诱导成骨成脂实验

图6HA-F127复合抑制UE7T-13凋亡并促进HGF及IL-10的旁分泌

本实验使用人永生化骨髓MSC(UE7T-13），具有无限增殖能力并维持良好的细胞状态和功能，且同MSC一样易于接受外源性基因的导入[5]。本研究选择FTH的MRI报告基因实现MSC活体示踪的目的，因为其可利用内源性铁离子进行MRI，不依赖外源性铁剂，具有相对更高的MRI灵敏度[8]。细胞基因导入的转运载体选择非常重要，本研究选择慢病毒载体，可将大片段的目的基因整合靶细胞DNA，并使目的基因长时间稳定表达，同时，其引起的免疫反应小[9,10]。构建的LV003-FTH-IRES-GFP慢病毒表达载体感染UE7T-1348h后，可同时表达FTH和GFP，荧光显微镜下可见GFP表达几乎达100%,Q-PCR检测提示感染细胞中FTHmRNA的表达提高了3倍，蛋白免疫印迹法显示感染细胞中FTH可随着时间延长表达增多，并至5d仍稳定高效表达，并被证实可用于MSC的体外MRI，这为下一步动物实验提供成像基础。

有研究者指出MSC治疗肝纤维化疗效欠佳，可能与肝纤维化微环境中存在的大量炎症因子，直接导致移植的MSC大量逃逸和死亡有关[3,4,6,7]。HA和PluronicF127制备的水凝胶（HA-F127）不仅具有良好的生物相容性和安全性，还具有温度敏感性，可用于常温下注射，并在37℃呈凝胶状，注射后能够构建MSC移植后生存的微环境，促进其滞留、存活及旁分泌等功能[11,12,13]。本研究证实，HA-F127在体外不影响FTH/UE7T-13的增殖能力，且不影响MSC的成脂成骨能力。

在H2O2诱导凋亡情况下，D组细胞凋亡率低于C组；同时证实在过氧化损伤情况下，D组细胞上清液中HGF及IL-10分泌较C组明显增多。上述结果可能与HA-F127改善细胞存在的微环境，促进MSC的存活而进一步增加其旁分泌功能有关，同时，HGF及IL-10作为抗凋亡及抗炎因子也发挥了抗过氧化而减少细胞损伤作用[14,15]。

综上所述，表达LV003-FTH-IRES-GFP慢病毒感染UE7T-13后可稳定高效表达FTH，可用于MSC的体外MRI，而且不影响UE7T-13分化增殖能力；同时，HA-F127可通过改善UE7T-13的微环境从而抑制MSC凋亡，提高旁分泌能力。该结果为本课题组进一步开展水凝胶复合MSC治疗肝纤维化提供了研究基础。

赖丽莎,郭媛,梁莹莹,胡晓俊,卢雄.温敏性水凝胶抑制间充质干细胞凋亡并促进旁分泌及过表达FTH的细胞MRI的实验研究[J].新医学,2020,51(08):595-600.

基金:广东省自然科学基金(2018A030313700,2018A030313511);广西壮族自治区卫生健康委员会自筹经费科研课题(Z20190110)