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RA患者TNF-α、IL-10、miR-149水平及rs22928323基因多态性之间的相关性
摘要：目的：了解深圳地区类风湿性关节炎（RA）患者微小RNA-149(miR-149）水平及其基因rs22928323位点单核苷酸多态性（SNPs），并探讨其多态性与肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-10(IL-10）及miR-149水平之间的相关性。方法：选择2017年3月-2019年4月在中国科学院大学深圳医院风湿科门诊或住院部就诊并确诊为RA患者157例为RA组，同期健康人群120名为HC组，采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中TNF-α、IL-10水平，采用实时荧光定量PCR法检测PBMCs中的miR-149 mRNA表达相对水平，同时采用限制性内切酶片段长度多态性聚合酶链反应技术（PCR-RFLP）对miR-149基因rs22928323位点SNPs进行检测，并对检测结果进行统计分析。结果： RA组TNF-α和miR-149水平分别为（38.19±10.73)pg/mL和（2.91±0.40），明显高于HC组（15.38±6.08)pg/mL和（1.46±0.27），而IL-10水平为（137.26±10.82)pg/mL，明显低于HC组（210.54±16.70)pg/mL，差异有统计学意义（P<0.05);RA组miR-149基因rs22928323位点CC基因型和C等位基因检出率分别为20.38%和43.63%，明显高于HC组的11.67%和27.92%，差异有统计学意义（P<0.05）；携带miR-149基因rs22928323位点CC基因型的RA患者TNF-α和miR-149水平>TC>TT基因型，而CC基因型RA患者的IL-10水平<TC<TT基因型，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 ：RA患者TNF-α和miR-149水平明显升高，而IL-10水平明显降低，且miR-149基因rs22928323位点呈多态性分布，与TNF-α、miR-149及IL-10水平有关，提示miR-149可能与RA发病有一定关系。
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微小RNA(micro RNA,miR）是细胞基因调控的重要组成部分，除了参与细胞生长、凋亡、增殖、组织及器官分化外，还参与机体免疫系统的调控[1,2]。其中miR-149是miR成员之一，位于2号染色体上，其基因位点存在单核苷酸多态性。研究表明，miR-149基因多态性突变会通过影响人体内miR-149及一些细胞因子水平来参与类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis,RA）疾病的发生和发展[3,4,5]，但不同区域和人群因遗传背景、生活习惯及环境等诸多因素的不同而存在一定的差异。为此，本研究对深圳地区157例RA患者和120名健康人群的肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10）、miR-149水平，及其基因rs22928323位点多态性与TNF-α、IL-10水平之间的相关性进行了对比研究，现报道如下。
1、材料与方法
1.1研究对象
选择2017年3月-2019年4月在中国科学院大学深圳医院（光明）医院风湿科门诊或住院部就诊并确诊为RA患者157例（RA组），其中男31例，女126例，男女比为1∶4.06，年龄34～78岁，平均（49.27±15.34）岁，患者均符合《2018中国类风湿关节炎诊疗指南》标准[6]，所有患者排除肿瘤、感染、严重心血管疾病及其他自身免疫性疾病。选择同期来医院体检的健康人群120名（HC组），其中男23名，女97名，男女比为1∶4.21，年龄37～76岁，平均（50.68±14.36）岁，均无自身免疫性及骨与关节相关性疾病。两组均排除精神病、严重器质性疾病、怀孕及哺乳期妇女。两组的年龄、性别等一般资料之间差异无统计学意义（P>0.05）。本研究经患者及其家属同意并签署知情同意书。
1.2仪器与试剂
ABI7500 PCR基因扩增仪、qubit4.0核酸荧光蛋白定量仪购自美国ABI公司；DNA提取试剂购自深圳亚能生物技术有限公司；TNF-α、IL-10 ELISA试剂盒购自深圳市科润达生物工程有限公司；AE275全自动免疫分析仪购自深圳爱康科技有限公司。
1.3方法
1.3.1标本采集
清晨采用研究对象空腹静脉血3份，其中第1份2 mL加入EDTA-K2抗凝管内混匀用于全血DNA提取，第2份3～5 m L枸橼酸钠抗凝管内混匀用于miR-149表达相对水平检测，第3份3～5 mL加入一次性无抗凝剂的干燥管内，分离血清，用于TNF-α、IL-10水平测定。
1.3.2TNF-α、IL-10水平检测
采用ELISA法检测TNF-α、IL-10水平。所有操作均严格按照试剂盒和仪器说明书及科室的SOP操作规程进行，并在相同条件下进行，确保检测结果的可比性。
1.3.3全血DNA提取
全血DNA提取所有操作均严格按照试剂盒及仪器说明书进行，提取后DNA的浓度和纯度采用核酸荧光蛋白定量仪进行检测，调整DNA最终浓度到100 ng/μL后置于-20℃保存，用于miR-149表达相对水平及其基因多态性分析。
1.3.4miR-149表达相对水平检测
(1)总RNA提取：严格按试剂盒操作说明书配置逆转录反应体系，合成cDNA，取2μL cDNA作为模板，配制252μL RT-PCR反应体系；(2)PCR扩增条件：95℃预变性5 min，然后以94℃变性60 s,55℃退火30 s,72℃延伸60 s，反复循环30次，最后72℃延伸10 min;(3)miR-149表达相对水平计算：采用目的基因Ct值减去内参基因Ct值得到的△Ct计算出2-△△Ct值来表示miR-149表达相对水平。
1.3.5miR-149基因rs22928323位点多态性分析
(1)引物设计：上游引物为5'-GTC TTC ACT CCC GTG CTT GT-3'，下游引物为5'-CCC GAA ACA CCC GTA AGA TA-3';(2)PCR反应体系：反应总体系为20μL，其中2×Mix 10μL,Primer F和Primer R各1μL,DNA 5μL,ddH2O 3μL;(3)PCR扩增条件：95℃预变性5 min，然后以95℃变性30 s,58℃退火45s,72℃延伸40 s，反复循环32次，最后72℃延伸10 min;(4)酶切产物：10×NE Buffer 2μL，内切酶0.5U,PCR产物4μL,ddH2O 13.5μL,37℃水浴1 h;(5)电泳：PCR扩增产物和酶切产物用2%琼脂糖凝胶电泳，然后观察并记录结果。
1.4统计学分析
采用GraphPad Prism 5软件对所测数据进行统计分析，呈正态分布计量资料采用（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析；计数资料采用（%）表示，组间比较采用c2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2、结果
2.1两组TNF-α、IL-10及miR-149水平比较
RA组TNF-α和miR-149水平明显高于HC组，而IL-10水平明显低于HC组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
表1 RA组与HC组TNF-α、IL-10及miR-149水平比较
2.2两组miR-149基因rs22928323位点基因型及等位基因检出率比较
RA组miR-149基因rs22928323位点CC基因型和C等位基因检出率明显高于HC组，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。
表2 RA组和HC组miR-149基因rs22928323位点基因型及等位基因检出率比较[n(%)]
2.3不同基因型RA患者TNF-α、IL-10及miR-149水平比较
携带miR-149基因rs22928323位点CC基因型的RA患者TNF-α和miR-149水平>TC>TT基因型，而CC基因型RA患者的IL-10水平<TC<TT基因型，差异均有统计学意义（P<0.05），见表3。
表3不同基因型RA患者TNF-α、IL-10及miR-149水平比较
3、讨论
RA是一种以慢性侵蚀性关节滑膜炎和关节外表现为主要特征的系统性自身免疫性疾病，为临床上常见的一种关节性疾病，全球患病率约为0.5%～1.0%，我国约为0.42%，近年来呈上升趋势[7]。RA病情因反复发作，易导致软骨和关节骨破坏，造成关节畸形和功能障碍，严重者甚至残疾，是常见的致残性疾病之一，严重影响患者生活质量[8,9,10]。RA病因十分复杂，其发病机制目前尚未完全明确，且RA临床症状不典型，临床表现较为多元，给诊断工作造成极大困难[11]。因此，探索RA发病机理及影响因素，对RA患者的诊断、治疗及疗效判断具有重要的意义。
有研究表明，RA发病可能与体内Th1/Th2细胞分泌细胞因子功能失衡有关。TNF-α是主要由Th1细胞分泌的一种细胞因子，通过抗原呈递，招募细胞毒性T细胞和CD4+T细胞而在自身免疫疾病的反应过程中促进细胞免疫，而IL-10是主要由Th2细胞分泌的一种细胞因子，通过CD8+T细胞诱发持续免疫抑制，减轻机体炎症反应[12,13]。有研究表明，TNF-α和IL-10水平与RA的发病有密切的关系[3,12,14]。本研究结果显示，RA患者血清中TNF-α水平明显升高，而IL-10水平明显降低，这可能与RA患者体内Th1分泌功能亢进及Th2分泌功能受到抑制有关。
miRNA是一类自然发生的非蛋白编码单链小分子RNA，长度约为21～24个核苷酸，参与细胞的生长、分化、增殖及凋亡等多种生物过程，可通过其抑制目标mRNA翻译来调控实现对靶基因蛋白表达的调节，在RA的发病中发挥了重要作用[15,16]。其中miR-149是miR成员之一，其在辅助性T细胞（Th）分化、T细胞依赖性抗原抗体反应及细胞因子生成的免疫过程中起着重要的调控作用[17,18]。本研究结果表明，RA患者PBMC中的miR-149表达相对水平明显升高，与有关文献报导一致[1,19]，这可能与关节滑膜成纤维细胞在多种炎症细胞因子刺激下过度增生而引起miR-149表达水平升高有关，具体互相作用机制有待进一步研究分析。
RA发病机制十分复杂，目前尚未完全阐明。有研究表明，RA发病与自身免疫、感染及遗传等诸多因素有关，其中遗传基因突变在RA发生和发展中起了重要的作用[20]。其中miRNA编码区域所存在的基因位点多态性突变可能影响miRNA的表达、剪切及成熟，从而影响miRNA对靶基因的调控而在RA发病中发挥重要作用[21]。本研究结果显示，深圳地区RA患者miR-149基因rs22928323位点CC基因型及C等位基因检出率明显升高，表明miR-149基因rs22928323位点多态性突变可能与本地区RA发病有密切关系，其中CC基因型及C等位基因可能是导致RA发病的危险易感基因之一。本研究结果还显示，miR-149基因rs22928323位点CC基因型RA患者TNF-α和miR-149水平明显升高，而IL-10水平明显降低，说明miR-149基因rs22928323位点多态性突变与一些炎症细胞因子水平有关，也表明miR-149基因突变可能通过影响miR-149及一些炎症细胞因子的水平表达而在RA的发病中发挥作用。
综上所述，TNF-α和miR-149水平在RA患者中升高，促进细胞免疫，而IL-10水平明显降低，在RA发病中起到免疫抑制作用，减轻炎症反应。同时深圳地区RA患者miR-149基因rs22928323位点存在多态性突变，且与TNF-α、IL-10及miR-149水平有关，可能与本地区RA发病有密切关系。
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主办单位：中华中医药学会
出版地方：北京
专业分类：医学
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