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肺结核患者中Tim3Galectin-9的表达研究

2020-08-21 299 上传者：管理员

摘要：目的：研究负性协同刺激分子T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(Tim3）/半乳凝素9(Galectin-9）在肺结核患者中的表达情况，探讨其在肺结核发生中的免疫作用。方法：收集2018年1-10月确诊的肺结核患者94例，结核菌潜伏感染者33例和未感染者26例，取外周血2mL，应用ELISA法检测血清中sTim-3/Galectin-9水平。结果：94例肺结核患者中，初治51例，复治43例。与未感染组[0.422(0.143,1.090）]和潜伏感染组[0.181(0.045,0.689）]比较，肺结核组[3.538(1.237,32.980）]血清中sTim-3水平明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），复治组[19.110(2.603,83.650）]血清中sTim-3水平高于初治组[2.267(0.641,5.282）]，差异有统计学意义（P<0.05）；与未感染组[541.1(351.2,601.2）]和潜伏感染组[468.2(384.3,637.0）]分别比较，肺结核组[691.1(446.8,1705.0)]Galectin-9水平明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），复治组[1233.0(519.5,3700.0）]血清中Galectin-9水平明显高于潜伏感染组和初治组[531.8(395.6,835.4）]，差异有统计学意义（P<0.05）。肺结核患者血清中sTim-3和Galectin-9为正相关（r=0.609、P=0.000）。结论：肺结核患者血清中sTim-3/Galectin-9水平在不同疾病状态时存在差异，提示sTim-3/Galectin-9在疾病的进展中起非常重要的作用，为进一步深入研究肺结核发病机制奠定了基础。

关键词：
Galectin-9
可溶性T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3
慢性传染病
肺结核
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结核病（TB）是由结核分枝杆菌引起的一种慢性传染病，每年有1000多万新发病例，目前仍是全球最关注的公共卫生问题之一[1]。T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3是TIM家族的一个受体蛋白，是一类特异性表达于Th1细胞表面的受体，在Treg细胞、T细胞、先天免疫细胞（自然杀伤细胞、树突状细胞、单核细胞）表面表达。Tim3有多种配体，如磷脂酰丝氨酸、半乳凝素9(Galectin-9）、HMGB1和CEACAM-1。由其配体Galectin-9激活后，Tim3会抑制效应T细胞的活性，并引起外周耐受[2]。课题组先前研究发现，可溶性Tim3(sTim-3）在结核病患者外周血清中表达明显升高[3]，但是关于Tim3及其配体Galectin-9在疾病进展中是如何发挥作用的，尚未见文献报道。本研究拟检测肺结核患者不同发病阶段血清中sTim-3/Galectin-9水平，初步探讨其在肺结核发生中的作用。

1、材料与方法

1.1研究对象

选择2018年1-10月在新疆维吾尔自治区人民医院呼吸科诊治的肺结核患者94例，年龄19～75岁，平均年龄49.80岁，其中男52例，女42例，初治51例，复治43例。筛选条件：肺结核患者及潜伏感染者均符合肺结核诊断指南标准（中华人民共和国卫生行业标准肺结核诊断WS288-2017)[4]；排除肝肾功能异常、哮喘、慢性支气管炎、肿瘤、免疫缺陷性疾病患者及免疫调节剂使用者等。未感染组26人，结核菌潜伏感染组33例，两组年龄、性别及族别与肺结核患者匹配，两组年龄均为21～70岁，平均年龄分别为46.23岁、44.61岁。所有研究对象均签署知情同意书，本研究经新疆维吾尔自治区人民医院伦理学委员会审查批准。

1.2所用试剂及仪器

人sTim-3和Galectin-9ELISA试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。酶标仪购自Thermo公司。

1.3样本处理

收集所有研究对象全血，常温2500r/min离心10min后，留取血清，-80℃冻存，实验操作前，室温解冻并混匀，注意血清样本避免反复冻融。

1.4ELISA法检测血清中sTim-3水平

sTim-3标准品依次稀释为2000、1000、500、250、125、62.5、31.2pg/mL;Galectin-9标准品依次稀释为6000、3000、1500、750、375、187.5、93.5pg/mL，严格按试剂盒说明书进行操作。450nm吸光度值由Thermo酶标仪读取，结果判读时以空白孔调零为准，根据标准品相应的浓度值和吸光度值绘制标准曲线，将待测样本血清的吸光度值代入标准曲线中，计算样品血清中sTim-3和Galectin-9含量。

1.5统计学分析

采用SPSS17.0软件进行统计分析。符合正态分布计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用t检验；不符合正态分布计量资料采用[M(P25,P75）]表示，两组间比较采用Mann-WhitneyU检验。相关性分析应用Person法。检验水准α=0.05。

2、结果

2.1肺结核患者外周血中sTim3水平

与未感染组[0.422(0.143,1.090）]和潜伏感染组[0.181(0.045,0.689）]比较，肺结核组[3.538(1.237,32.980)]sTim-3水平明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），见图1A。进一步将肺结核组分为初治组和复治组，发现初治组[2.267(0.641,5.282）]和复治组[19.110(2.603,83.650）]血清中sTim-3水平明显高于潜伏感染组，复治组血清中sTim-3水平高于初治组，差异有统计学意义（P<0.05），见图1B。提示sTim-3在结核菌感染的不同状态水平存在差异，并且随着肺结核发展sTim-3水平呈上升趋势。

图1肺结核患者血清中sTim-3水平

2.2肺结核患者外周血中Galectin-9水平

与未感染组[541.1(351.2,601.2）]和潜伏感染组[468.2(384.3,637.0）]分别比较，肺结核组[691.1(446.8,1705.0)]Galectin-9水平明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），见图2A。进一步将肺结核组分为初治组[531.8(395.6,835.4）]和复治组[1233.0(519.5,3700.0）]，发现复治组血清中Galectin-9水平明显高于潜伏感染组和初治组，差异有统计学意义（P<0.05），见图2B。提示Galectin-9在结核菌感染的不同状态水平存在差异，并且在反复发病的肺结核患者中Galectin-9水平呈上升趋势。

图2肺结核患者血清中Galectin-9水平

2.3肺结核患者血清中sTim3与Galectin-9正相关

将肺结核患者血清中sTim-3、Galectin-9水平进行直线相关性分析。sTim-3和Galectin-9为正相关（r=0.609、P=0.000）。

3、讨论

结核病是全球最关注的公共卫生问题之一，多数研究表明，结核病是与免疫相关的感染性疾病[4,5,6]。T细胞免疫初期限制结核菌感染，但是无法完全消灭结核菌，反而反复发病。Tim-3是Tim家族成员，与其配体Galectin-9结合可显著抑制T细胞的活化和增殖，促进Treg细胞的增殖及抑制功能，诱导免疫耐受[7,8,9]，其与感染、哮喘、癌症等疾病的发生发展都密切相关[8,10,11,12,13]。

杨宜等[10]研究表明，通过功能性单抗阻断Tim3/Galectin-9通路可缓解结核病理状态，有效提高机体免疫水平，抑制结核的发生发展。课题组前期研究发现sTim-3可能通过参与肺结核患者体内Th1/Th2免疫失衡，促进肺结核的发生[3]，但Tim3/Galectin9途径在疾病发展不同进程中是如何发挥作用的，尚未见文献报道。辛燕等[14]研究发现，随着棘球蚴感染时间的增加，棘球蚴病患者血清中可溶性Tim3/Galectin-9的浓度升高，且两者成正相关，而且Tim3/Galectin-9途径促进Th1/Th2细胞失衡现象发生，从而促进感染的持续性发展[15]。本研究发现肺结核患者血清中可溶性Tim3蛋白水平显著高于健康人群，且随着肺结核患者疾病程度加重，血清中可溶性Tim3蛋白水平不断升高，与ChávezGalán等[11]的研究结果一致。本研究结果表明血清中可溶性Tim3蛋白不仅可以判断受试者是否为肺结核患者且可根据严重程度来判断肺结核患者是初治还是复治。Galectin-9在复治肺结核患者血清中的表达明显高于初治肺结核患者，其作为Tim3的配体，与肺结核反复发病密切相关。进一步分析发现可溶性Tim3/Galectin-9随着病程的进展，两者在肺结核患者血清中浓度升高，且成正相关，提示Tim3/Galectin-9在疾病进展过程中两者协调发挥作用。

本研究肺结核患者血清中sTim-3/Galectin-9水平不同疾病状态时存在差异，提示sTim-3/Galectin-9在疾病的进展中起非常重要的作用，sTim-3可能在疾病初期通过与其它配体相互作用发挥作用，反复发病时Galectin-9激活，促进疾病的恶化，为进一步深入肺结核发病机制的研究奠定了基础。肺结核发生发展中，初治阶段Tim3可能通过与其他配体相互作用发挥免疫抑制功能，在反复发病时，Tim3与其配体Galectin-9结合发挥作用，是否同时也与其他配体作用未知，在不同病程阶段，Tim3/Galectin-9是如何发挥免疫调控等问题，需后期构建动物模型进一步深入研究。

参考文献：

[3]张佳,张峰波,李奇凤,等.肺结核患者血清中可溶性T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(sTim-3)和IL-4水平升高但IFN-γ水平降低[J].细胞与分子免疫学杂志,2016,32(7):968-971.

[4]高孟秋.《WS288-2017肺结核诊断》新标准中关于临床诊断患者判定的解析[J].中国防痨杂志,2018,40(3):243-246.

[8]刘亚男,余追,姚兰,等.Galectin-9/Tim-3信号通路在HBV感染中对机体固有免疫及适应性免疫调控的研究进展[J].中国免疫学杂志,2018,34(10):1590-1595.

[9]姚兰,刘亚男,余追.T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3/凝集素9通路在脓毒血症免疫调控中的研究进展[J].微循环学杂志,2018,28(1):71-74,79.

[10]杨宜,杨芳,陈玲铭,等.阻断T细胞Tim3/Galectin9通路介导抗结核菌感染免疫保护[J].热带医学杂志,2018,18(6):708-711,694.

[12]杨涛,张杨,许依婷,等.哮喘患者外周血单个核细胞TIM-3及Galectin-9的表达与临床意义[J].现代检验医学杂志,2016,31(1):52-54.

[14]辛燕,马秀敏,吴梦茹,等.Tim-3､sTim-3与Galectin-9在棘球蚴病感染过程中的变化特点[A].第九届全国免疫学学术大会,2014.

[15]赵慧,张峰波,庞楠楠,等.Tim-3/Galectin-9与Th1/Th2相关因子在人细粒棘球蚴感染中的表达研究[J].新疆医科大学学报,2016,39(3):312-315,319.

穆合塔尔·木合买提,李奇凤,赵晶,余亮.Tim3/Galectin-9在肺结核患者中的表达研究[J].热带医学杂志,2020,20(08):1033-1035+1055.