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Caspase抑制剂对AD患者外周血CD4+T细胞亚群分泌细胞因子的影响

2020-08-26 202 上传者：管理员

摘要：目的:明确广谱半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)抑制剂对特应性皮炎(AD)患者外周血CD4+T细胞亚群分泌细胞因子的影响。方法:广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK与30例AD患者外周血单一核细胞(PBMCs)体外共培养后,PBMCs分为3组,分别加入Z-VAD-FMK溶液、地塞米松溶液和PBS溶液。流式细胞仪检测CD4+T细胞亚群;ELISA方法检测上清液中IFN-γ、IL-4、IL-17的浓度。结果:IFN-γ、IL-4、IL-17水平在PBS溶液组高于Z-VAD-FMK组,差异均有统计学意义(均P<0.01),在Z-VAD-FMK组与地塞米松组间比较,均无统计学意义(均P>0.05)。结论:广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK可抑制AD患者PBMC中CD4+T细胞Th1、Th2、Th17分泌相关细胞因子。

关键词：
CD4+T细胞
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶
特应性
皮炎
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特应性皮炎是一种反复发作并伴有剧烈瘙痒的慢性炎症性皮肤疾病。关于AD的发病机制目前尚未完全明了,T细胞介导的异常免疫反应对AD的发生发展可能起主要作用[1,2]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶是细胞凋亡过程中的重要因子,近年发现,该家族部分成员(尤其是caspase-3及caspase-8)在T细胞活化与增殖中亦发挥重要作用[3,4],有可能成为免疫性及炎症性疾病新的治疗方向。目前对caspase在炎症性皮肤病中的研究较少。我们既往的研究表明,广谱caspase抑制剂苄氧羧基-缬氨酰-丙氨酰-门冬氨酰氟甲基酮可以抑制小鼠变应性接触性皮炎[5,6]。有学者发现[7],AD患者急性期皮损表皮角质形成细胞中caspase-3表达增加,但他们的研究结果局限在表皮内,没有观察真皮及血液内的淋巴细胞中caspases表达的情况,亦没有用caspase抑制剂进行干预并观察干预后的变化。本实验以AD患者为对象,将广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK与患者外周血单一核细胞体外共培养,研究caspase抑制剂在体外对AD患者T细胞免疫异常的影响。该研究将为从阻断caspase方面来治疗包括AD在内的免疫性及炎症性皮肤病提供理论及实验依据,为研制新型抗免疫及抗炎症药物提供依据。

1、材料与方法

1.1对象

AD患者30例,其中男17例,女13例,年龄18～65岁,平均40.6岁,所有患者均符合Williams标准。在2周内未外用糖皮质激素类药物及口服抗组胺药物,4周内未系统应用糖皮质激素或免疫抑制剂治疗。对照组30例均为本院体检的健康成人,其中男18例,女12例,年龄22～60岁,平均38.5岁,无特应性疾病病史。两组性别与年龄比较,其差异均无统计学意义。本研究通过本院伦理委员会批准,受试者均签署知情同意书。

1.2试剂与仪器

1.2.1主要试剂

Z-VAD-FMK购自美国Promega公司,使用时用磷酸盐缓冲液(phosphate-bufferedsaline,PBS)稀释。地塞米松购自美国Sigma公司,使用时用PBS稀释。佛波酯和离子霉素购自美国Alexis公司,莫能霉素购自美国Sigma公司。PE-Cy5标记的抗人CD3单抗、FITC标记的抗人CD8单抗、PE标记的同型对照IgG1单抗购自美国BD公司。PE标记的抗人γ干扰素(IFN-γ)、人白细胞介素4(IL-4)、人白细胞介素17(IL-17)单抗购自美国eBioscience公司。人IFN-γ、IL-4、IL-17ELISA试剂盒购自美国eBioscience公司。

1.2.2主要仪器

流式细胞仪型号为FACSCalibur,系美国BD公司产品,ELISA检测仪为美国BioTek公司产品。

1.3方法

1.3.1单一核细胞分离

取30例AD患者及30例健康对照肝素抗凝血5mL,Ficoll密度梯度离心法分离PBMCs,重悬于含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养液中,调整细胞浓度至2×106/mL。

1.3.2流式细胞仪检测CD4+T细胞亚群

取上述PBMC悬液1mL,接种于24孔板,加入佛波酯(终浓度50μg/L)+离子霉素(终浓度1mg/L)及莫能霉素(终浓度1μmol/L),37℃50mL/LCO2培养箱中培养4h。然后把细胞悬液移至1.5mL离心管,1500r/min离心5min,弃上清,PBS溶液洗2次后进行流式细胞仪检测。由于佛波酯可以减弱CD4的表达,本实验未采用荧光素标记的CD4抗体,而用CD3+CD8-细胞群代替CD4+细胞群。

1.3.3ELISA方法检测培养上清液中的细胞因子

取上述PBMC悬液1mL,接种于24孔板,将30例AD患者的PBMC均分3孔,每孔均加入佛波酯(终浓度50μg/L)+离子霉素(终浓度1mg/L),然后再分别加入等量的Z-VAD-FMK溶液、地塞米松溶液及PBS溶液,使Z-VAD-FMK终浓度为100μmol/L,地塞米松终浓度为250nmol/L。置于37℃50mL/LCO2培养箱中培养24h。然后把细胞悬液移至1.5mL离心管,1500r/min离心5min,收集上清液。ELISA方法检测上清液中IFN-γ、IL-4、IL-17的浓度。

1.3.4统计学方法

采用SPSS17.0统计分析软件,计量资料以(x±s)表示。AD患者与健康对照之间的比较采用成组设计资料两样本均数比较的t检验,各处理组之间的比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1AD患者外周血单一核细胞中Th1、Th2、Th17细胞比例

佛波酯+离子霉素刺激培养AD患者及健康对照PBMC4h后,用流式细胞术检测细胞膜表面标记和细胞内细胞因子。结果显示,AD患者组CD3+CD8-IFN-γ+(Th1)细胞比例低于健康对照组(P<0.01),CD3+CD8-IL-4+(Th2)细胞比例明显高于健康对照组(P<0.01),CD3+CD8-IL-17+(Th17)细胞比例明显高于健康对照组(P<0.01)。见表1、图1。

表1AD患者及健康对照组外周血表达不同细胞因子的CD4+T细胞亚群水平(%,x¯±s)

2.2Z-VAD-FMK对AD患者外周血单一核细胞培养上清液IFN-γ、IL-4、IL-17的影响

AD患者PBMCs中加入佛波酯+离子霉素刺激培养,然后再分别加入等量的Z-VAD-FMK溶液(终浓度100μmol/L)、地塞米松溶液(终浓度250nmol/L)及PBS溶液,培养24h,ELISA方法检测上清液中IFN-γ、IL-4、IL-17的浓度。结果显示,与PBS处理组这一阴性对照相比,Z-VAD-FMK处理组与地塞米松处理组IFN-γ、IL-4、IL-17水平均显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.01);与地塞米松处理组这一阳性对照相比,Z-VAD-FMK处理组IFN-γ、IL-4、IL-17水平的差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表2、图2。

图1AD患者及健康对照组外周血表达不同细胞因子的CD4+T细胞亚群水平的流式细胞图

表2广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK对特应性皮炎患者外周血单一核细胞分泌IFN-γ、IL-4、IL-17的影响(ng/L,x±s)

图2Z-VAD-FMK对特应性皮炎患者外周血单一核细胞分泌细胞因子的影响

3、讨论

特应性皮炎是一种慢性、反复发作的炎症性皮肤病,主要症状有剧烈的瘙痒、广泛的红斑脱屑等湿疹样皮损以及干皮症等,严重影响患者及其家人的生活。在过去30年中,许多国家特应性皮炎的患病率大幅度增加。特应性皮炎的发病机制尚不明确,目前认为AD是遗传、环境、皮肤屏障功能缺陷和免疫异常共同作用的多基因复杂疾病,CD4+T细胞介导的异常免疫反应一直是AD发病机制的研究热点。以往多项研究表明,Th2细胞占优势的Th1/Th2平衡失调是免疫介导的AD发生环节之一。Th17是新近发现的CD4+T细胞亚群,有研究显示,AD患者外周血和皮损中Th17细胞数量均增多,其百分比与疾病本身的严重程度相关[8,9]。

在本实验中,我们观察了AD患者外周血单一核细胞中Th1、Th2、Th17细胞的比例,发现与健康对照相比,Th1细胞明显下降,Th2与Th17细胞明显升高,这与其他学者的研究结果一致[2,9]。

近年来的研究表明,caspases不仅参与细胞凋亡,其在T细胞增殖与活化中亦发挥着重要作用。主要体现在以下方面:T细胞体外活化过程中检测到多种caspases的活性;caspase-8失活后导致了人与鼠T细胞免疫缺陷;体外实验中,caspase抑制剂能阻断抗CD3单抗、有丝分裂原及超抗原诱导的T细胞的增殖与活化。目前,关于在体内研究caspases在T细胞活化中的作用以及caspase抑制剂抗免疫反应的报道较少。Iwata等[10]将广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK应用于小鼠哮喘模型,他们发现,经尾静脉注射Z-VAD-FMK进行干预后,小鼠气道及肺血管中炎细胞浸润明显减少,黏液分泌及Th2细胞因子分泌也减少,T细胞在体外受到刺激后产生Th2细胞因子的能力也明显下降。我们既往研究亦表明,外用广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK治疗小鼠变应性接触性皮炎(ACD)有一定的疗效[5],且可以抑制小鼠ACD的激发[6]。国内外尚未见到将其用于特应性皮炎的研究。

在本实验中,我们以特应性皮炎患者为研究对象,进一步观察了广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK对AD患者PBMCs培养上清液中IFN-γ、IL-4、IL-17的影响。参照既往文献报道[11],Z-VAD-FMK的终浓度设为100μmol/L,以PBS溶液为阴性对照,以250nmol/L地塞米松溶液为阳性对照。结果发现,与阴性对照相比,Z-VAD-FMK处理组与地塞米松处理组IFN-γ、IL-4、IL-17水平均显著降低。这提示,广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK对AD患者外周血Th1、Th2、Th17等CD4+T细胞分泌相关细胞因子的能力均有抑制作用。本实验还发现,与地塞米松处理组这一阳性对照相比,Z-VAD-FMK处理组IFN-γ、IL-4、IL-17水平的差异均无统计学意义。这提示,广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK对AD患者外周血CD4+T细胞的抑制作用与250nmol/L地塞米松相似。

有研究发现[7],AD患者急性期皮损表皮角质形成细胞中caspase-3表达增加,但他们的研究结果局限在表皮内,没有观察真皮内浸润的淋巴细胞中caspases表达的情况,亦没有用caspase抑制剂进行干预并观察干预后的变化。在本实验中,我们观察了caspase抑制后对AD患者外周血CD4+T细胞的影响,今后可以对AD皮损中浸润的淋巴细胞进行相关研究,并进一步应用至动物模型中。

虽然已在部分炎症性疾病的动物实验中观察到caspase抑制剂抗免疫、抗炎症的作用,但尚未进行临床试验,考虑可能与相关研究仍较少有关。今后需要进行更多的研究进一步加以验证,为研制新型抗免疫及抗炎症药物提供依据。

参考文献：

[2]高来强,王海英,聂艳,等.红蓝光治疗特应性皮炎疗效评价及对IL-2､IL-10和IFN-γ表达的影响[J].中国麻风皮肤病杂志,2015,31(2):99-100.

[5]李圆圆,阎春林,徐薇.广谱半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂抗小鼠变应性接触性皮炎的研究[J].中华医学杂志,2008,88(44):3153-3156.

[6]李圆圆,阎春林.外用广谱半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂抑制小鼠变应性接触性皮炎的激发[J].中华医学杂志,2012,92(28):1992-1996.

[9]喻泸,王华,罗晓燕.他克莫司及金黄色葡萄球菌肠毒素B对特应性皮炎外周血Th17细胞的影响[J].中华皮肤科杂志,2014,47(2):120-123.

李圆圆,郝宝珍,孟云芳.Caspase抑制剂对特应性皮炎患者外周血CD4+T细胞亚群分泌细胞因子的影响[J].中国麻风皮肤病杂志,2020,36(09):533-536.