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骨髓增生异常综合征患者骨髓细胞中BCL2L10的表达及其启动子甲基化状态的临床意义

2020-09-07 236 上传者：管理员

摘要：目的：探讨骨髓增生异常综合征患者骨髓细胞中BCL2L10的表达及其启动子甲基化状态的临床意义。方法：采用real-timePCR方法对56例MDS患者(MDS组)以及30例非白血病患者(非白血病对照组)骨髓标本的BCL2L10基因表达水平进行定量检测,MDS患者按修正的国际预后积分系统(IPSS-R评分)分为低/中危MDS组(IPSS-R评分≤4.5,33例)和高危MDS组(IPSS-R评分>4.5,23例)。采用甲基化特性PCR分析BCL2L10基因启动子区甲基化状态,同时在临床MDS样本和GEPIA数据库中对比分析BCL2L10表达水平与疾病预后的关系。结果：MDS组患者BCL2L10基因表达水平较非白血病对照组显著降低(P<0.05),高危MDS组患者骨髓标本中BCL2L10基因表达水平显著低于非白血病对照组和低/中危MDS组(P<0.05)。BCL2L10基因表达水平受甲基化调控,高危MDS组患者BCL2L10基因启动子区甲基化阳性率(56.52%)明显高于非白血病对照组(36.67%,P<0.05)及低/中危MDS组(30.30%,P<0.05);且BCL2L10基因启动子区甲基化状态与MDS患者的危险度分层密切相关(χ2=5.79,P<0.05),而与年龄、性别无统计学差异(P>0.05)。在24例未予以甲基化药物治疗的患者中,BCL2L10高表达组患者3年生存率低于BCL2L10低表达组(83.3%vs50.0%),采用GEPIA数据库对BCL2L10在急性髓系白血病中进行预后比较,同样发现低表达组的预后较高表达组差,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论：BCL2L10基因表达水平及其甲基化状态可作为判断MDS预后的指标之一。

关键词：
BCL2L10基因
甲基化
预后
骨髓增生异常综合征
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骨髓增生异常综合征是一组起源于造血干细胞的髓系克隆性疾病,具有较大的异质性,其临床表现及疾病预后存在明显差异。BCL2L10基因属于Bcl-2家族成员,通过与Apaf-1结合阻断其与Bcl-XL形成复合物,从而引起细胞凋亡[1-2]。但也有研究认为BCL2L10为抗凋亡蛋白,可以阻断由减少IL-3或Bax诱导的细胞凋亡。研究发现,BCL2L10表达受甲基化调控,其异常表达与血液系统恶性肿瘤、肝癌、胃癌、乳腺癌等多种肿瘤的发生、转移、耐药及预后密切相关[3-6]。VIDAL等[7]研究发现,在MDS和急性非淋巴细胞白血病中,BCL2L10表达升高与去甲基化药物抵抗相关。BCL2L10基因过表达可抑制急性髓系白血病细胞株HL-60增殖并促进细胞凋亡[8]。BCL2L10表达水平与MDS患者预后分层是否具有相关性尚不明确。本研究旨在探讨不同危险度分层的MDS患者骨髓细胞中BCL2L10表达水平及其启动子甲基化状态与疾病预后的关系。

1、资料与方法

1.1研究对象

收集2011年2月至2017年10月空军军医大学唐都医院收治的原发未治MDS患者56例(MDS组),均符合维也纳诊断标准[9-10],其中男性31例,女性25例,年龄20～89岁,中位年龄69岁,检测标本为科室液氮冻存的骨髓标本。患者进行MICM分类诊断,并按照2016年WHO修订的分型标准进行分型。另收集同期非白血病标本30例(非白血病对照组),其中初诊未治缺铁性贫血18例(男性6例,女性12例,中位年龄54岁),营养性贫血12例(男性7例,女性5例,中位年龄66岁),检测标本为新鲜采集的骨髓标本。入组患者均按照MDS修正的国际预后积分系统(IPSS-R评分系统)[11-12]对56例MDS患者进行评分,IPSS-R评分≤4.5定义为低/中危MDS组(low/medianriskMDS,L/MRMDS),IPSS-R评分>4.5定义为高危MDS组(highriskMDS,HRMDS)。

1.2骨髓标本中BCL2L10表达量检测

RNA提取采用Qiagen总RNA提取试剂盒说明进行。应用TaKaRa逆转录试剂盒说明扩增cDNA,取1μLcDNA作为模板,于ABI7500荧光定量PCR仪上采用SYBRGreen(TaKaRa公司)法检测BCL2L10表达量,以β-actin作为内参。记录各个反应管Ct值,使用2-△△Ct对结果进行相对定量分析。

1.3甲基化特异性PCR(methylationspecificPCR,MSP)检测

基因组DNA提取参照Qiagen公司DNA提取试剂说明书进行。利用UCSC基因组浏览器(http://genome.ucsc.edu/)查询并分析BCL2L10基因序列,参考文献[13],分别设计并合成BCL2L10基因启动子区CpG岛甲基化和非甲基化引物(表1)。

基因组DNA亚硫酸氢化处理:采用CpGenomeTMDNA修饰试剂盒(ChemiconInternationalInc.),获得修饰后的DNA片段进一步采用Promega公司DNA纯化试剂盒纯化。BCL2L10基因启动子区甲基化PCR:反应在9700PCR仪(AppliedBiosystems)上进行,总反应体系25μL,1.5mmol/LMgCl2,0.1mmol/LdNTP,0.4μmol/L上下游引物,GoldTMDNAPolymerase(ThermoFisher)1U,模板DNA2μL。反应条件:95℃变性5min,95℃30s,62℃(甲基化)/59℃(非甲基化)30s,72℃60s,循环40次,72℃延伸8min。PCR产物经3%琼脂糖凝胶电泳,EB染色,紫外灯下观察条带位置并照相。

表1BCL2L10启动子区甲基化和非甲基化引物

1.4统计学分析

采用SPSS19.0统计软件,BCL2L10基因表达水平差异比较采用z检验和t检验,两组间阳性率的比较采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1两组患者骨髓组织中BCL2L10基因表达差异

采用real-timePCR方法对比分析了非白血病对照组患者与MDS患者骨髓组织中BCL2L10基因表达水平,发现与30例非白血病对照组患者相比,MDS患者BCL2L10基因表达水平降低(P<0.05,图1)。

图1非白血病对照组与MDS患者骨髓组织中BCL2L10基因表达水平

2.2BCL2L10基因表达水平与MDS患者危险度的关系

56例MDS患者按照MDS修正的国际预后积分系统(IPSS-R评分系统)分为低/中危MDS组(IPSS-R评分≤4.5)33例,高危MDS组(IPSS-R评分>4.5)23例。与非白血病对照组相比,低/中危MDS组患者骨髓标本BCL2L10基因表达水平无明显差异(P>0.05),而高危MDS组患者骨髓标本中BCL2L10基因表达显著低于非白血病对照组和低/中危组MDS患者(P<0.05,图2)。

图2不同危险度分层MDS患者骨髓组织中BCL2L10基因表达

2.3采用甲基化特异性PCR检测MDS患者BCL2L10基因启动子区甲基化状态

30例非白血病对照组患者骨髓标本中,11例(36.67%)检测到BCL2L10基因启动子区甲基化(图3A);56例MDS患者骨髓标本中,23例(41.07%)检测到BCL2L10基因启动子区甲基化,33例低/中危MDS组有10例(30.30%)检测到BCL2L10基因启动子区甲基化(图3B);而23例高危MDS组有13例(56.52%)检测到BCL2L10基因启动子区甲基化(图3C)。高危MDS组患者BCL2L10基因启动子区甲基化阳性率显著高于非白血病对照组和低/中危MDS组(P<0.05)。

图3非白血病对照组患者与MDS患者BCL2L10基因启动子区甲基化状态检测

2.4BCL2L10基因启动子区甲基化状态与MDS患者临床特征之间的关系

如表2所示,BCL2L10基因启动子区甲基化状态与MDS患者的年龄、性别均无统计学差异(P>0.05),与MDS患者骨髓原始细胞比例具有明显的相关性(P<0.05),24例原始细胞比例≤5%的MDS标本中,5例检测到BCL2L10基因启动子区甲基化(阳性率20.83%),在32例原始细胞比例>5%的MDS标本中,18例检测到BCL2L10基因启动子区甲基化(阳性率56.25%),提示BCL2L10基因启动子区甲基化状态与骨髓组织中原始细胞比例密切相关(P<0.05,表2)。BCL2L10基因启动子区甲基化状态与MDS患者的危险度分层密切相关,高危组MDS患者BCL2L10基因启动子区甲基化阳性率显著高于低/中危组MDS患者(χ2=3.85,P<0.05)及非白血病对照组患者(χ2=4.91,P<0.05),而低/中危组MDS患者骨髓中BCL2L10基因启动子区甲基化阳性率与非白血病对照组患者无统计学差异(χ2=0.07,P>0.05)。

2.5BCL2L10基因表达水平与生存期的关系

56例MDS患者中,24例未给予去甲基化药物治疗。将24例患者BCL2L10表达量的中位值作为阈值分为高表达组和低表达组,对两组患者3年总生存率(overallsurvival,OS)进行统计分析发现,BCL2L10高表达组3年生存率为83.3%,低表达组仅为50.0%,两组比较差异无统计学意义(P=0.072,图4A)。同时采用GEPIA数据库对BCL2L10在急性髓系白血病中进行预后比较,同样发现低表达组的预后较高表达组差,但差异无统计学意义(P=0.084,图4B)。

表2MDS患者临床特征与BCL2L10基因启动子甲基化状态的关系

图4BCL2L10基因表达水平与MDS患者总生存率的关系

3、讨论

BCL2L10,也称为Diva、Bcl-b或Boo,是Bcl-2蛋白质家族的成员,广泛参与调节细胞凋亡和自噬的信号通路[1,14],但BCL2L10基因在恶性肿瘤中的功能尚不完全一致,NAUMANN等[15]发现,BCL2L10与Bcl-2家族蛋白功能类似,通过与APAF-1结合,抑制人神经胶质瘤细胞凋亡。与之相反,在胃癌、AML中,BCL2L10基因作为促凋亡基因,抑制肿瘤的进展[16]。本研究检测56例MDS患者及30例非白血病对照组患者骨髓细胞中BCL2L10基因表达及其启动子甲基化情况。发现MDS患者BCL2L10基因表达水平较非白血病对照组患者降低,在41.0%的MDS患者骨髓细胞中检测到BCL2L10启动子甲基化,并与其低表达相关,表明启动子甲基化导致的BCL2L10沉默可能参与了MDS发生发展的关键步骤。

VOSO等[17]研究发现,BCL2L10基因启动子高甲基化的MDS患者其IPSS评分多为高危组,且表现为预后差、易转向AML转化、总生存期短等特征。因此,本研究按照IPSS-R评分系统将56例MDS患者进行分组,并分别对比分析了不同危险度分层的MDS患者BCL2L10基因表达差异及其启动子甲基化状态,发现高危组MDS患者骨髓标本中BCL2L10基因表达水平显著低于非白血病对照组患者和低/中危组MDS患者,而高危组MDS患者BCL2L10基因启动子甲基化阳性率较非白血病对照组和低/中危组明显升高,提示该基因表达水平及其启动子甲基化状态可作为MDS诊断的分子标记、预后判断及治疗靶点。

2018年美国NCCN关于MDS诊疗指南中,明确将地西他滨、阿扎胞苷等去甲基化药物作为高危组MDS患者治疗的首选药物[18]。MIKATA等[16]研究发现,使用1μmol/L地西他滨处理胃癌细胞24h,可引起BCL2L10基因启动子区CpG岛发生去甲基化,BCL2L10蛋白表达升高,从而引起胃癌细胞发生凋亡,因此BCL2L10基因是地西他滨作用靶标之一。地西他滨能够逆转对阿霉素耐药的HL-60/ADR的耐药性,并提高Kasumi-1对化疗药物的敏感性,并且对于复发/难治的急性非淋巴细胞白血病患者,将地西他滨作为化疗前预处理药物,可以增强患者对化疗药物的敏感性,提高总生存,改善患者预后[19]。本研究也证实采用地西他滨治疗的MDS患者中,BCL2L10高表达组患者3年OS高于BCL2L10高表达组患者,尽管没有统计学意义,可能与纳入的患者数较少有关。BCL2L10基因作为地西他滨作用的重要靶基因之一,其甲基化水平决定了去甲基化药物的治疗效果和临床反应,本研究为MDS临床治疗提供了重要的理论依据。

及月茹,刘利,严学倩,李国辉,陈怡,张阳萍,秦炜炜.BCL2L10基因表达及其启动子甲基化在骨髓增生异常综合征中的临床意义[J].第三军医大学学报,2020,42(17):1687-1692.

基金:陕西省自然科学基础研究计划青年项目基金(2107JQ8028);陕西省重点研发计划(2019SF-080).