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基于宏基因组学的新疆牧场羊潜在人兽共患病原菌调查

2021-09-08 257 上传者：管理员

摘要：目的探究新疆牧场羊携带微生物多样性及潜在人兽共患病原菌种类,为有效防治人兽共患病提供理论依据。方法选取新疆喀什和石河子市牧场羊群,同期采集羊口咽拭子和肛拭子样品,提取DNA,采用宏基因组二代测序,比对Minikrakenv2数据库,测序结果进行物种注释、多样性和差异性分析,了解两地区羊携带的细菌种类。结果共采集羊口咽拭子72份和肛拭子231份。门水平上,两样品占主导地位的微生物为变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门;属水平上,两样品的优势菌属均不相同,共检出10种主要以食源性传播为主的人兽共患病原菌:大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、鲍曼不动杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、蜡样芽孢杆菌、化脓性链球菌和猪链球菌。经主坐标(PCoA)分析和相似性(ANOSIM)分析,两地区间羊携带细菌和潜在人兽共患病细菌的差异均有统计学意义(P<0.05)。结论新疆地区牧场羊口咽部和肛门部菌群存在多样性及地区差异性,检出的人兽共患病原菌以食源性传播为主,存在食品安全和疾病传播风险。

关键词：
人兽共患病
宏基因组
细菌多样性
羊
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人兽共患病是发生于人和动物间的传染性疾病，病毒、细菌或寄生虫可作为其病原体，通过直接或间接接触传播给人类[1,2,3]。宏基因组测序技术对样本中的核酸直接进行测序，与微生物数据库进行比对分析，根据比对得到的序列信息判断样本包含的病原微生物种类，能够快速检测出样本中较多的病原微生物，且无需特异性扩增[4]。由于关于中国羊体内细菌菌群及携带的人兽共患病原菌的研究较少，因此本文采用宏基因组测序方法了解新疆羊呼吸道及消化道中主要的细菌种类和分布情况，以及其携带的人兽共患主要病原菌，为羊健康养殖和相关疾病预防控制提供一定的基础科学数据。

1、材料和方法

1.1样品来源

样品来自新疆南疆(喀什市)和北疆(石河子市)的大型牧区，于2019年8月同期进行样品采集。其中，石河子市采得羊肛拭子140份，羊口咽拭子43份；喀什市采得羊肛拭子91份，羊口咽拭子29份，共303份样品。为避免交叉污染，均使用一次性棉拭子采集样品，并密封在无菌容器中，利用车载冰箱运回实验室，保存于-70℃超低温冰箱。

1.2DNA提取及测序

收集的样品由武汉华大基因公司进行DNA提取及检测。按照DNA提取试剂盒(CTAB方法)提取样品全基因组DNA。检测DNA的完整性采用1%琼脂糖凝胶电泳法。通过酶标仪测量DNA水平。按照同地区采集的DNA样品混合，羊口咽样品每6份一组，获得12组构建文库；羊肛样品每7份一组，得33组构建文库。文库构建及上机测序同由武汉华大基因科技服务有限公司完成。

1.3序列处理及统计分析

BGISEQ测序所得原始序列数据用FLASH软件进行拼接，经Trimmomatic软件将拼接得到的序列进行质控过滤，使用Kraken2软件以及配套的Minikrakenv2数据库进行物种分类。应用R软件进行主坐标分析(principalcoordinateanalysis,PCoA)和相似性分析(analysisofsimilarity,ANOSIM),使用Python(V3.6包)Statsmodels(V0.10.1)进行Wilcoxon秩和检验分析潜在人兽共患病原菌的差异性。

2、结果

2.1测序数据

本研究最终获得12组羊口咽拭子和33组羊肛拭子样品的宏基因组数据，3045503100条序列，每组样品平均读长均为150bp。根据宏基因组序列数据分析，共得到4界27门47纲103目195科410属544种。45份羊样品中丰度占比最大的为细菌。选择3个层级即门、属和种的数据进行比较和展示。

2.2不同羊样品细菌种类的比较

2.2.1细菌种类的比较

在门水平上，羊口咽样品中检出前5位的细菌为变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门和软壁菌门；而羊肛样品中为变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门和疣微菌门。变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门在两种样品的细菌丰度均为最高(图1)。在属水平上，羊口咽样品中检出前5位的细菌为莫拉氏菌属、曼氏杆菌属、比伯斯坦菌属、巴氏杆菌属和不动杆菌属；而羊肛样品中为拟杆菌属、弯曲杆菌属、埃希氏菌属、丛毛单胞菌属和双歧杆菌属。在属水平上，羊口咽样品的细菌物种与羊肛样品的不大相同(图1)。

图1在门水平和属水平上不同羊样品细菌组成图

2.2.2人兽共患病细菌种类的比较

在种水平上，羊口咽样品与羊肛样品含有潜在的人兽共患病细菌为大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、大肠弯曲杆菌、蜡样芽孢杆菌、猪链球菌、空肠弯曲杆菌、沙门氏菌和鲍曼不动杆菌。使用Wilcoxon秩和检验对其进行差异分析，在不同样品间比较大肠杆菌和多杀性巴氏杆菌相对丰度差异有显著性(P<0.01),其他细菌差异均无显著性(P>0.05;图2)。

图2不同羊样品人兽共患病原菌种类的比较

a为P<0.01,与羊口咽样品比较。

2.3不同地区羊样品细菌种类的比较

2.3.1细菌种类的比较

在种水平上，喀什市羊口咽样品细菌种类前3为牛莫拉氏菌、溶血性曼氏杆菌和栖瘤胃普雷沃氏菌，羊肛样品前3为普通拟杆菌、大肠杆菌和粪拟杆菌；石河子市羊口咽样品细菌种类前3为溶血性曼氏杆菌、山羊海藻比伯斯坦菌和牛眼莫拉氏菌，羊肛样品前3为粪拟杆菌、丛毛单胞菌和普通拟杆菌。两市羊口咽样品共有的细菌种类为溶血性曼氏杆菌，羊肛样品共有的细菌种类为普通拟杆菌和粪拟杆菌(图3)。

图3在种水平上不同地区羊拭子样品中细菌种类的比较

2.3.2细菌种类多样性分析

对不同地区羊口咽及羊肛样品细菌种类进行基于Euclidean距离的PCoA分析，在属水平上，喀什市和石河子市羊口咽样品和羊肛样品的细菌种类都较为相似(图4A和B)。ANOSIM分析显示，在门水平上，喀什市和石河子市羊口咽样品间细菌群落差异有显著性(图4C);在种水平上，喀什市和石河子市羊肛样品间细菌群落差异有显著性(图4D)。

图4不同地区羊样品中细菌多样性分析和差异性分析

A和B为属水平;C为门水平;D为种水平;E和F为差异性分析。a为P<0.05,b为P<0.01,与喀什市比较。

在属水平上使用Wilcoxon秩检验对不同地区羊口咽和羊肛样品细菌种类进行差异分析，拟杆菌属和棒状杆菌属在喀什市和石河子市间比较差异有显著性(P<0.05;图4E);小杆菌属、欧陆森氏菌属、尿杆菌属、丙酸杆菌属和双歧杆菌属在喀什市和石河子市间比较差异有显著性(P<0.05,P<0.01;图4F)。

2.3.3人兽共患病细菌种类的比较

在种水平上，不同地区羊口咽和羊肛样品中存在的潜在人兽共患病细菌为多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、蜡样芽孢杆菌、鲍曼不动杆菌、猪链球菌、大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌、化脓性链球菌和沙门氏菌。使用Wilcoxon秩检验进行差异分析发现，在喀什市和石河子市间比较，羊口咽样品6种潜人兽共患病细菌均无统计学意义(P>0.05),而羊肛样品7种潜在人兽共患病细菌中，大肠弯曲杆菌和空肠弯曲杆菌差异有显著性(P<0.01),其他则差异均无显著性(P>0.05;图5)。

图5不同地区羊样品人兽共患病原菌种类的比较

a为P<0.01,与喀什市比较。

3、讨论

当前大部分国内外文献都是基于16SrRNA测序方法对羊瘤胃、肠道菌群微生物开展研究[5,6,7],很少有关于中国新疆地区羊体内的细菌菌群及携带的人兽共患病原菌的分析研究。本研究基于华大基因BGISEQ测序，通过宏基因组测序技术成功地检测了新疆羊口咽拭子及肛拭子细菌菌群的多样性，获得大量、全面的菌群信息。

反刍动物胃肠道的微生物组成具有较强的相似性是在门水平上，但在个体间的区别往往体现为物种的丰富度和多样性[8]。在本研究羊样品中，从不同羊样品的研究方向来比较，在门水平上，其呼吸道和消化道的占主导的细菌菌群为变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门，这与文献[6,9,10]研究的结果一致。有研究发现，拟杆菌门在绵羊肠道是优势物种[11];还有研究表明，厚壁菌门、放线菌门是反刍动物肠道中丰度最高、最具代表性的门水平物种[12];但也从候萌等[13]研究结果知研究的阿勒泰羊空肠内的优势物种里没有拟杆菌门，原因可能有：羊的品种、地理环境或者是饲喂草料的不同等。但是单从两组样品的各自的门分类上看，羊口咽样品和羊肛样品检出前4位的微生物都相同，不同之处在于各自排名第5位的微生物：软壁菌门(羊口咽)和疣微菌门(羊肛)。从Minozzi等[5]对绵羊后肠微生物菌群的研究可知，疣微菌门也是绵羊消化道核心菌群之一。在属分类水平上，两样品的优势菌属均不相同。有研究表明，拟杆菌属在蒙古羊肠道微生物里丰度较高的优势物种[14];有研究报告报导在2907个山羊样品和2382个绵羊样品中弯曲杆菌的检出率分别为17.8%和12.6%[15];Riggio等[16]也在羊的口腔黏膜采集的样本检测出莫拉氏菌。还有研究发现，莫拉氏菌属在索马里绵羊鼻拭子样本中是优势物种[17]。

从新疆南疆喀什市和北疆石河子市两个地区采集的羊样品来比较分析，结果表明，在种水平上的羊口咽样品，石河子市以溶血性曼氏杆菌、山羊海藻比伯斯坦杆菌、牛眼莫拉氏菌为优势菌；而喀什市采的羊口咽样品以牛莫拉氏杆菌、栖瘤胃普雷沃氏菌、溶血性曼氏杆菌为优势菌。两地的羊口咽样品共有的细菌为溶血性曼氏杆菌，江金欢等[18]也从西藏绵羊上呼吸道分离出溶血性曼氏杆菌。在种水平上的羊肛样品，两地区占主导的细菌菌群种类同为普通拟杆菌、粪拟杆菌和大肠杆菌。

主坐标(PCoA)分析，即经典多维标度(Classicalmultidimensionalscaling),是一种与PCA类似的用于研究数据间的相似性或者差异性的不具约束性的数据降维排序分析方法[19]。PCoA展示各个样品间的差异大小，较近的样本表明有很多相似的物种组成。ANOSIM分析，即相似性分析，用来检验组间(两组或多组)差异是否显著大于组内差异，从而判断分组是否有意义。从不同地区的羊样本分析，在种水平上的PCoA分析得出两地区的相同样品间的细菌种类均相似。ANOSIM分析结果均得出两地区相同的羊样品间的比较有显著差异。

在此次的研究中，不仅检出大量常规细菌，还检出人兽共患病原菌，且大部分属于细菌性食源性病原菌。此次样品发现的潜在的人兽共患病细菌有10种：大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、鲍曼不动杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、蜡样芽孢杆菌、化脓性链球菌和猪链球菌[20]。钟世勋等[21]对山羊鲍曼不动杆菌的病原性研究证实鲍曼不动杆菌为人兽共患病原菌。两种羊样品中的大肠杆菌和多杀性巴氏杆菌两组间的比较有极显著差异(P<0.01);从不同地区采集的样品方向来比较，两地的羊口咽样品间潜在人兽共患病细菌的比较均无统计学意义(P>0.05);而两地的羊肛样品间有大肠弯曲杆菌和空肠弯曲杆菌2组潜在人兽共患病细菌的比较有极显著差异(P<0.01)。人兽共患病原菌的存在，可对羊和牧民的健康造成不良影响，还有可能通过羊源性食品这一媒介导致食源性疾病或人兽共患病的发生，影响社会的公共卫生安全。

综上，利用宏基因组学技术，对新疆地区羊的病原菌群组成及其呼吸和消化系统中的微生物多样性特征进行细菌门、属和种的划分，对数据进行多样性分析，还分别比较了不同样品与不同地区羊细菌菌群的差异性；了解了新疆羊口咽部和肛门的菌群的优势菌属和差异菌属；检出了以食源性传播为主的人兽共患病原菌，表明存在一定的食品安全和疾病传播风险。本研究为羊健康养殖和相关疾病预防控制提供了一定的科学数据。

文章来源：陈紫昕,刘海灿,屈勇刚,邓云丽,宋德强,徐春生,祁凤华,万康林,刘志广,袁秀琴.基于宏基因组学的新疆牧场羊潜在人兽共患病原菌调查[J].中南医学科学杂志,2021,49(05):497-501.