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人鼠嵌合弓形虫免疫球蛋白M重组抗体制备及J链对其聚体形成的影响

2021-09-17 293 上传者：管理员

摘要：目的体外制备人鼠嵌合弓形虫免疫球蛋白M(TOX-IgM)抗体,并验证加入J链对IgM抗体蛋白聚体、效价及稳定性的影响。方法从美国国家生物信息中心数据库获取抗体的重链可变区、轻链可变区以及J链序列,通过DNA重组技术分别将TOX抗体轻重链可变区和人源恒定区进行拼接,构建人鼠嵌合IgM表达载体,转染HEK293F细胞进行表达。观察J链相关效应。结果J链有利于抗体聚体形成(聚体占比由11.3%提升至75.5%),抗体效价由1∶40提升至1∶160;在37℃热稳定性实验及反复冻融实验中,TOX-IgM(J+)稳定性与TOX-IgM(J-)相当。通过酶联免疫吸附试验鉴定蛋白活性,本实验成功制备人鼠嵌合TOX-IgM抗体,经聚丙烯酰胺凝胶电泳还原显示,重链大小约为75000,轻链大小约为25000,符合预期;效价、稳定性、基质效应均满足需求。结论在连接链J链(15000蛋白)存在下,IgM抗体更易形成五聚体,即5个IgM单体通过二硫键和J链彼此之间相互连接,且经评价效价和稳定性均有了明显提升。

关键词：
DNA重组技术
J链
人鼠嵌合弓形虫免疫球蛋白M抗体
感染所有可见的温血动物
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弓形虫感染在世界各地的人类和动物中很常见。它能够感染所有可见的温血动物，包括人类、牲畜和海洋哺乳动物。研究显示，全球范围内约1/3的人类均感染过弓形虫，但在不同人群之间差异显著。在大多数具有免疫能力的人群中，感染弓形虫后无明显症状;然而，新生儿和免疫缺陷人群感染弓形虫后会引起严重疾病，甚至死亡[1]。因此，孕产妇弓形虫检测就显得尤为必要。目前特异性免疫球蛋白(Ig)G、IgM酶联免疫吸附试验在临床应用最普遍，来判断体内有无弓形虫病毒及病毒感染情况。其中特异性抗体IgM在人体最早产生并进行早期防御，随后产生IgG抗体，可见IgM抗体检测有判定是否存在近期感染，辅助预测感染风险的用途，这就使得人鼠嵌合弓形虫免疫球蛋白M(TOX-IgM)抗体作为阳性样本在体外诊断中显得尤为重要[2]。然而目前市场中TOX-IgM阳性质控品大多是收集的高值血浆，存在不同样本相互干扰、来源匮乏、收集困难、不能大规模生产的局限性[1,2,3]。本研究中使用HEK293F细胞表达重组抗体，HEK293F细胞为人胚胎肾细胞293，是由人肾胚细胞衍生而成，易于体外培养且转染效率高，目前被广泛地应用于抗体蛋白工业化生产[4,5]。IgM分子在血清中以大聚合物的形式呈现，主要是五聚体[6,7,8]。本研究利用基因工程技术，采用人鼠嵌合抗体设计，将鼠源抗弓形虫抗原P30特异性IgG抗体可变区基因与人源IgM抗体恒定区基因拼接重组，转入哺乳动物细胞表达。同时将J链构建到哺乳动物真核表达载体中，验证其是否对IgM抗体蛋白聚体结构形式有影响。质控品采用重组抗体技术制备可以替代传统高值血清样品，这对体外诊断中酶联免疫吸附试验检测TOX-IgM抗体有着重要作用，这也将对研究者们对IgM等亚型抗体聚体生成形式的研发提供新思路。

1、材料与方法

1.1实验材料

HEK293F细胞购买于北京义翘神州科技有限公司;载体质粒pCMV3为本实验室长期保存;感受态细胞(大肠杆菌DH5a)购自天根生化科技(北京)有限公司。限制性核酸内切酶EcoRI、BamHI、T4DNALigase购自美国Gibco公司;琼脂糖凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自天根生化(北京)有限公司;转染试剂Sinofection-293、基础培养基SMM293-TⅡ和补料培养基(SMM293-SUPI)均购自北京义翘神州科技有限公司;P30抗原购自美国Meridian公司;ProteinL亲和层析凝胶购自美国GE公司。聚合酶链反应(PCR)仪(美国ThermoFisher公司，VeritiThermalCycler);离心机(日本Sigma公司，1-14);电泳仪(北京六一生物科技有限公司，DYCP-32B);凝胶成像系统(美国Bio-rad公司，UniversalHoodⅡ);摇床(瑞士阿道夫科耐公司，ISF1-XC);细胞计数仪(上海睿钰，IC1000);超微量分光光度计(美国ThermoFisher公司，NanoDropOne);蛋白纯化系统(美国GE公司，AKTApurifierTMUPC10)，弓形虫IgM抗体检测试剂盒(厂商品牌:Trinity、欧蒙、美德声、索林、维润赛润、高达、贝尔、艾康、安图、罗氏)。

1.2基因序列的获取

从美国国家生物信息中心数据库获取鼠抗P30抗原的轻链、重链可变区基因序列(AF031635.1,AF031636.1)，并合成人Kappa轻链恒定区编码序列(J00241)、人IgM重链恒定区编码序列(X14940)和J链基因序列(NM＿144646.3)。5条基因序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3嵌合抗体基因的克隆与拼接

通过PCR将鼠源重、轻链可变区(VH/VL)，人源重、轻链恒定区(CH/CL)分别扩增，再使用OverlapPCR技术分别将VH/VL与重、轻链恒定区(CH/CL)以及相应的信号肽拼接，分别得到拼接片段H和拼接片段L;J链直接PCR扩增(JF/JR)，为基因片段J。设计的引物见表1。

1.4表达载体构建

通过酶切连接技术将拼接片段H和拼接片段L构建至真核表达载体PCMV3上，限制性内切酶位点为HindⅢ/XbaⅠ，形成人鼠嵌合抗弓形虫抗体表达质粒(H-pCMV3,L-pCMV3)，同时使用相同的方法将基因片段J构建至pCMV3中得到质粒J-pCMV3。

1.5细胞转染与表达

使用SMM293-TⅡ培养基复苏HEK293F细胞，传代2～3次至细胞稳定;转染前1天，按照2×106个/ml细胞密度接种(30ml/瓶，2瓶);转染当天，计数并稀释细胞密度至3×106个/ml，设置2组实验:实验组TOX-IgM(J+)按照H-pCMV3∶L-pCMV3∶J-pCMV3质粒含量10∶10∶1的比例投入，对照组TOX-IgM(J-)按照H-pCMV3∶L-pCMV3质粒含量1∶1的比例投入。转染试剂Sinofectin-293按其说明书，稀释质粒DNA和脂质体，以1μg∶5μl比例转染细胞。转染后每隔一天添加SMM293-SUPI补料液1.05ml，至细胞活力降至50%左右1500r/min离心5min(离心半径16cm)收获蛋白上清。此蛋白表达实验重复3次。

1.6蛋白纯化

将TOX-IgM(J+)组和TOX-IgM(J-)组收获的重组抗体细胞上清使用0.45μm滤膜过滤，同时分别用超纯水和缓冲液(0.02mol/L的磷酸盐缓冲液，pH7.4)平衡装有ProteinL填料的层析柱，将过滤后的蛋白上清上样、再次平衡，最后使用解离缓冲液(0.1mol/L的柠檬酸钠，pH值2.3)洗脱目的蛋白抗体，收集解离峰，使用分光光度计检测蛋白含量并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效液相色谱分析技术检测蛋白表达水平。

1.7酶联免疫吸附试验检测

选用间接法酶联免疫吸附试验检测目的蛋白活性。首先酶标板使用1mg/L的P30抗原包被，4℃孵育过夜;磷酸盐吐温缓冲液洗涤4次后，37℃条件下，2%BSA封闭1h;磷酸盐吐温缓冲液重新洗涤1次，加入已经纯化的TOX-IgM人鼠嵌合抗体(初始浓度为100mg/L,1/3梯度稀释，磷酸盐缓冲液做阴性对照)，37℃孵育1h;加HRP标记的羊抗人二抗，37℃孵育1h;洗涤后加入四甲基联苯胺显色液显色10min，加入2mol/L的硫酸终止液，震荡后使用酶标仪读取450nm处的吸光度值。

2、结果

2.1重组质粒酶切鉴定

将构建的H-pCMV3,L-pCMV3和J-pCMV3重组载体提取质粒，经HindⅢ/BamHⅠ酶切后、琼脂糖凝胶电泳分析，重链大小约为1750bp，轻链大小约为700bp,J链大小约为500bp(图1)，且条带单一，与预期相符。

2.2细胞状态与蛋白表达量监测

实验组TOX-IgM(J+)和对照组TOX-IgM(J-)转染后24h开始隔天添加1次补料。期间每天取样稀释，使活细胞密度为1×105个/ml，监测细胞密度与存活率(表2)。结果显示，转染宿主细胞后3d细胞密度到达高峰期，随后活细胞密度与活细胞率开始逐步下降，在活细胞率50%左右收获目的蛋白抗体。TOX-IgM重组抗体蛋白上清经ProteinL亲和层析柱纯化后，根据抗体浓度、体积以及收获上清量换算其最终蛋白表达量。结果分析:TOX-IgM(J+)组和TOX-IgM(J-)组细胞状态(活细胞密度和活细胞率)无显著差异，转染3d后活细胞数目达到峰值，随后开始下降;转染后24h细胞活率达到99%，而后活细胞率持续下降至第7天收获。经换算:TOX-IgM(J+)组蛋白表达量为(29.4±3.0)mg/L,TOX-IgM(J-)组蛋白表达量为(30.7±2.5)mg/L。结果表明，J链对TOX-IgM表达量无明显影响，加J链组抗体蛋白表达量略低。

2.3抗体蛋白检测

根据蛋白质印迹分析TOX-IgM(J+)实验组和TOX-IgM(J-)对照组分泌的抗体蛋白，结果显示J链对于抗体蛋白聚体的形成影响显著(聚体占比由11.3%提升至75.5%)，抗体效价由1∶40提升至1∶160。经聚丙烯酰胺凝胶电泳还原处理后，抗体蛋白二硫键打开，重链呈现分子量大小约为75000，抗体轻链分子量大小为25000左右，与预期相符。结合分子筛高效液相色谱法，利用凝胶过滤层析的原理来分析检测目的蛋白(图2)。结果显示，纯化后的TOX-IgM(J-)组目的蛋白大多为单体形式存在(大小在200000左右，占比85.4%)，而TOX-IgM(J+)组单体形式明显减少(16.3%)，大多为聚体形式存在(大小在800000左右，占比75.5%)。

2.4蛋白效价检测

将对照组与实验组纯化后蛋白分别于9个厂家的试剂盒进行对比检测效价，结果显示，实验组TOX36#(J+)对比其他厂家试剂盒效价明显提升16～800倍，对照组TOX36#(J-)对比其他厂家试剂盒效价明显提升21～800倍。

2.5蛋白稳定性检测

将纯化后液态蛋白与冻干粉放在37℃培养箱7～14d时间，液态蛋白再进行反复冻融7～10次，期间在第7、10、14天分别监测其稳定性，另设置对照组(一直冻存于-20℃的蛋白)。结果显示，实验组TOX-IgM(J+)在37℃热稳定性实验和反复冻融实验中稳定性较好，其变幅均≤5%，而液态蛋白在37℃热稳定性实验中稳定性有所下降，变幅在30%～40%之间;对照组TOX-IgM(J-)在37℃热稳定性实验和反复冻融实验中稳定性与TOX-IgM(J+)差异不大，然而液态蛋白在37℃热稳定性实验中稳定性有所下降，变幅在50%～60%之间。

2.6蛋白基质效应检测

将重组单抗做4℃和37℃8d的2组实验，检测正常人血清基质液的基质效应。结果显示内控盘(真值)的变幅较小，说明重组抗体在加速后的基质效应小;且重组单抗与内控盘、浓缩液变幅几乎保持一致，因此证明重组抗体的基质效应符合要求。见表3。

2.7蛋白活性检测

P30抗原包被酶联板，使用上述所制备的抗体蛋白TOX-IgM进行酶联免疫吸附试验检测，结果显示，本研究制备的TOX-IgM人鼠嵌合抗体可以与P30抗原结合，表明本研究所制备的人鼠嵌合TOX-IgM具有良好的免疫反应性。

3、讨论

弓形虫是弓形虫病的病原体，是胞内专性原生动物寄生虫[9]。在大部分温血生物宿主的有核细胞中，弓形虫都可以侵入并且繁殖。特别是孕妇如果在怀孕期间感染弓形虫病在一定程度上会通过胎盘将弓形虫病原体传播给胎儿，且严重时会导致其流产、死产。新生儿患弓形虫病会引起各种临床症状，如脑积水、小头畸形、脑钙化、发育迟缓等问题。研究发现，妊娠1～3个月和妊娠中期母亲感染弓形虫导致胎儿死亡的比例分别为5%和2%，先天性弓形虫病的发病率约为1.5/1000。由此可见，妊娠期感染因子的检测是非常重要的，因为它们不仅威胁母亲的健康，而且会导致胎儿畸形。检测抗弓形虫IgM可以及时对孕产妇急性母体感染进行预警并治疗处理，这对预防新生儿感染至关重要[10]。

TOX-IgM是目前临床检测人体是否近期感染弓形虫病原体的重要指标。在本研究中，釆用DNA重组技术手段将鼠源抗P30抗体的可变区基因(VH/VL)分别与人源IgM亚型抗体的Fc段恒定区基因序列进行拼接，转染真核表达系统HEK293细胞中，通过亲和层析方式纯化得到体外诊断中抗弓形虫IgM的阳性质控品[11,12]，这种体外培养抗体蛋白的方法有利于工业化大规模生产。

IgM是B细胞活化后产生的第一类抗体[4,13]。本研究成功制备了人鼠嵌合TOX-IgM抗体，其效价由1∶40提升至1∶160;在37℃热稳定性实验及反复冻融实验中，TOX-IgM(J+)稳定性与TOX-IgM(J-)相当。通过酶联免疫吸附试验鉴定蛋白活性，结果显示效价、稳定性、基质效应均满足需求。此外，本实验验证了J链对IgM蛋白聚体形式的影响。J链在一定程度上调节并促进多聚体生成，减少单体形式;且同时对细胞状态、活细胞率和表达量进行监测显示[14],J链对宿主活细胞率、密度以及目的蛋白表达量无显著影响，但在本研究中使用体外培养法成功制备的人鼠嵌合抗TOX-IgM抗体，验证了哺乳动物细胞培养技术大规模制备重组IgM抗体的可行性[15,16]。这对于体外诊断行业，作为阳性质控品替代临床高值血清样本有着重要意义。TOX-IgM阳性质控品的确定有利于快速检测人体对弓形虫感染的情况且对IgM抗体聚体的研究提供了方向。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献杜伟鹏:直接参与;崔亚敏、田晓平:实施研究;王素娟:起草、撰写文章;付光宇、赵巧辉:采集、分析/解释数据

文章来源：杜伟鹏,崔亚敏,田晓平,王素娟,付光宇,赵巧辉.人鼠嵌合弓形虫免疫球蛋白M重组抗体制备及J链对其聚体形成的影响[J].中国医药,2021,16(09):1388-1392.