根皮素（phloretin），化学名为2,4,6-三羟基-3-(4-羟基苯基)苯丙酮，是一种二氢查耳酮类的多酚化合物。主要分布于苹果、荔枝等多汁水果的果皮及根皮中[1,2]。具有广泛的生物活性，如抗氧化[3]、抗炎[4]、抗肿瘤[5]等活性。此外，根皮素还具有美白保湿、延缓衰老等多种美容功效，在食品、药品、化妆品等领域具有广泛的应用前景[6]，但其溶解性差、生物利用度低严重限制了进一步开发利用[7]。

磷脂复合物是指药物与磷脂分子在非质子溶剂中反应所形成的稳定化合物或络合物，形成复合物后能改变药物的理化性质、增强皮肤和组织的渗透性，提高生物利用度，如咖啡酸磷脂复合物[8]、熊果苷磷脂复合物[9]。目前，对根皮素磷脂复合物（phloretinphospholipidcomplex,PHL-PC）的研究多集中在口服给药，而关于经皮给药研究较少[10]。基于根皮素在抗炎、抗氧化方面的应用前景，本实验拟采用Box-Behnken响应面法优化PHL-PC制备工艺，并对其理化性质、经皮渗透性及药动学特征进行考察，以期解决根皮素溶解性及经皮渗透性差、生物利用度低的问题，为该原料的进一步开发应用奠定基础。

1、材料与试剂

1.1仪器

DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；N-1200B型旋转蒸发仪，东京理化器械株式会社；SHZ-B型水浴恒温振荡器，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；GeneSpeedX1型离心机，美国GeneCompany;AL204电子天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；DZF-6050真空干燥箱，上海欣齐科学仪器有限公司；TP-6智能透皮扩散仪，天津市精拓仪器科技有限公司；LC-2030CD3PLUS岛津高效液相色谱仪，日本Shimadzu公司；TESCAN-VEGA3钨丝灯扫描电子显微镜（SEM），上海泰斯肯贸易有限公司；TAQ2000差示扫描量热仪（DSC），德国耐驰公司；UltimaIV普通X射线衍射仪（XRD），日本理学电机株式会社；TENSOR-27傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR），德国布鲁克公司。

1.2试药

根皮素对照品，批号20180712，质量分数≥98%，成都普菲德生物技术有限公司；大豆卵磷脂，批号C11362919，质量分数≥98%，上海麦克林生化科技有限公司；乙腈、甲醇为色谱级；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.3动物

SD雄性大鼠，体质量（240±20)g；购自成都达硕实验动物有限公司，动物生产许可证号SCXK（川）2020-030，动物实验经陕西中医药大学动物实验伦理委员会批准，所有动物实验遵循陕西中医药大学有关实验动物管理和使用的规定，均符合3R原则。

2、方法与结果

2.1PHL-PC的制备及复合率测定

称取根皮素和大豆卵磷脂于圆底烧瓶中，加入无水乙醇作为复合溶剂，置恒温磁力搅拌器搅拌2h，旋转蒸发除去乙醇。再加入氯仿复溶，滤过，收集滤渣干燥后称定质量。滤液经减压蒸干溶剂并真空干燥，即得PHL-PC。

M1为根皮素投药量，M2为滤纸上残留根皮素的质量

2.2分析方法的建立

2.2.1色谱条件

色谱柱为ShimadzuC18柱（250mm×4.6mm,5μm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液（45∶55）；柱温30℃；检测波长为280nm；体积流量0.8mL/min；进样量10μL。HPLC图见图1。

2.2.2对照品溶液的制备

精密称取根皮素对照品10mg，加入色谱纯甲醇溶解，定容至10mL，得1mg/mL根皮素对照品溶液。

2.2.3供试品溶液的制备

精密称取10mgPHL-PC，加入10mL色谱甲醇溶解，再精密吸取1mL上述溶液，加色谱甲醇稀释并定容至10mL，得供试品溶液。

2.2.4线性关系考察

取“2.2.2”项下对照品溶液，用甲醇稀释成20、40、60、80、100、120、200μg/mL的系列对照品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，以进样质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，得回归方程为Y=45072X+48436,r=0.9997，结果表明根皮素在20～200μg/mL时，质量浓度与峰面积具有良好的线性关系。

2.2.5精密度试验

取对照品溶液（100μg/mL），在“2.2.1”项色谱条件下进行测定，连续进样6次，记录峰面积，计算得根皮素峰面积的RSD为0.19%，表明仪器精密度良好。

2.2.6重复性试验

按“2.2.3”项下方法制备的供试品溶液6份，依“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算得根皮素质量分数的RSD为0.23%，表明该方法重复性良好。

2.2.7稳定性试验

取供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8、10h，依“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算得根皮素峰面积的RSD为0.29%，表明供试品溶液在10h内稳定性良好。

2.2.8加样回收率试验

取已测定的样品9份，分为3组，分别加入相当于样品中根皮素含量80%、100%、120%的对照品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，依“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算得平均加样回收率为98.52%,RSD为2.64%，表明该方法准确度良好。

2.3Box-Behnken设计-响应面法优化PHL-PC制备工艺

根据前期单因素实验结果，选择不同药脂比（药物与磷脂质量比，X1）、药物质量浓度（X2）、反应温度（X3）作为考察因素，通过DesignExpert12分析软件的Box-Behnken设计-响应面法进行试验设计，以复合率（Y）为评价指标筛选最佳工艺并进行验证，各因素水平、试验安排及结果见表1。

以Y为响应值进行二次方程模型拟合，得出拟合方程Y=92.54+1.63X1-1.87X2+1.57X3-1.20X1X2-2.35X1X3+1.15X2X3-3.40X12-3.60X22-3.49X32,r2=0.9518,P<0.001，对二次回归方程进行方差分析，结果见表2。由表2可知，模型的X1、X2、X3、X1X3、X12、X22、X32均具有显著性，失拟性检验不显著（P>0.05），表明该模型拟合程度良好，能较好地预测实际值。

根据二次回归方程拟合结果，绘制响应面的等高线图和3D效应曲面图，结果见图2。图2可以直观地反映2因素的交互作用对复合率的影响。由图2可知，X1、X3因素的等高线图呈椭圆形且其3D效应曲面图弯曲程度大，说明其交互作用强，为影响复合率的主要因素。

根据软件预测的最佳工艺处方药脂比为1.63，药物质量浓度为1.71mg/mL，反应温度55.9℃。结合实际条件，进行验证试验，重复3次，计算复合率，结果见表3。表明该模型具有良好的预测性，且工艺稳定可行。

2.4PHL-PC的表征

2.4.1SEM观察

取适量样品均匀涂布于铝箔表面上，室温下自然干燥，使用SEM观察根皮素、大豆卵磷脂、物理混合物（physicalmixture,PM）和PHL-PC的表面形态。结果如图3所示，根皮素为细长的棒状结构，在PM中也保留了这种形态，但在PHL-PC中，并未出现根皮素的结构。表明根皮素已高度分散在磷脂中，形成磷脂复合物。

2.4.2差示扫描量热（DSC）法分析

采用DSC法研究根皮素、大豆卵磷脂、PM和PHL-PC的热性能。选择30～350℃的温度范围，并在恒定氮气流下以10℃/min的加热速率扫描样品。各样品的DSC曲线图见图4。从图4可以看出，根皮素的热图在270℃左右显示出1个明显的吸热峰，说明根皮素以结晶状态存在。PM的热图中也在该位置出现了1个类似的根皮素峰，表明混合物分子间有微弱作用或完全没有相互作用。但是与PM相比，PHL-PC的热图中，并未出现该峰，这可能是由于复合物中存在弱分子力引起的，说明根皮素失去了原有的结晶性，根皮素以分子或无定型状态均匀的分散在磷脂复合物中。

2.4.3X射线衍射（XRD）法分析

通过XRD法研究磷脂复合物中根皮素的存在状态。铜K辐射源固定在40kV和40mA，扫描范围2θ为10°～80°，扫描速度2°/min。根皮素、大豆卵磷脂、PM和PHL-PC的XRD图谱如图5所示。根皮素和PM的图谱中都在10°～30°出现强的衍射峰，表明PM中根皮素的形态和根皮素粉末中相同，仍以结晶状态存在，但是，与PM相比，PHL-PC的图谱中并没出现该衍射峰。表明根皮素的晶体结构发生了显著变化，根皮素以无定型态高度分散在磷脂中，形成磷脂复合物，这与DSC结果一致。

2.4.4傅立叶变换红外光谱（FT-IR）法

采用KBr压片法研究各样品的红外吸收光谱。称取适量根皮素、大豆卵磷脂、PM和PHL-PC，分别与KBr粉末按照1∶100的质量比混合后压片，在4000～400cm-1波数处进行FT-IR分析，结果如图6所示。根皮素的谱图中，特征峰为1634cm-1(C=O）；大豆卵磷脂的特征峰为1740cm-1(C=O）、1067cm-1(P-O-C);PM的谱图为根皮素和大豆卵磷脂谱图的简单叠加，说明两者只是混合，并未发生分子间作用；而在PHL-PC的图谱中，根皮素的特征峰（C=O）由1634cm-1红移至1606cm-1且峰强显著减弱，表明根皮素与大豆卵磷脂之间可能存在氢键缔合，形成磷脂复合物。

2.5平衡溶解度研究

称取过量等量的根皮素和PHL-PC粉末（以根皮素含量计），各加入至5mL蒸馏水或正辛醇中，37℃恒温摇床（100r/min）震荡24h后，各取1mL样品，13500r/min离心10min，上清液甲醇稀释后进样测根皮素含量，计算溶解度，结果见表4。根皮素制成磷脂复合物后，在水和正辛醇中的溶解度分别提高到4.90、2.20倍。

2.6表观油水分配系数（P）的测定

称取适量等量根皮素和PHL-PC粉末（以根皮素含量计），分别加入2mL油相（水过饱和的正辛醇）中，超声溶解，5000r/min离心10min得油相溶液，定量稀释后，进样测根皮素含量，记为C0，精密量取1mL上述油相溶液，再加1mL水相（正辛醇过饱和的水），37℃恒温摇床（100r/min）震荡24h后，离心取上清液，甲醇定量稀释后，进样测根皮素含量，记为C1。按照公式P=C1/(C0-C1)（其中C0为正辛醇中药物的初始含量，C1为分配平衡时药物在油相中的含量，C0-C1为分配平衡时药物在水相中的含量）计算油水分配系数。结果如表5所示，制成磷脂复合物后根皮素脂溶性明显提高。

2.7体外溶出度研究

精密称取等量根皮素和PHL-PC，溶解于pH7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）中（以根皮素含量计，1mg/mL）。精密吸取各溶液5mL添加至透析袋中（截留相对分子质量14500），透析袋置于20mL释放介质中，37℃恒温搅拌（100r/min）进行体外溶出度试验。分别于0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、6、8、10、12、24h取样1mL，同时补充等量溶出介质。HPLC测根皮素含量，计算累积释药率（R）。

Cn代表第n个取样点根皮素质量浓度，Ci代表当前取样点之前的各取样点质量浓度，V和Vs分别代表释放介质体积和取样体积，Q0代表根皮素的初始量

根皮素和PHL-PC累积释放曲线如图7所示，根皮素及PHL-PC的累积释药率在24h分别达到72.07%和86.34%，表明复合物的体外溶出性明显优于根皮素，这可能是因为磷脂复合物具有两亲性，加速了根皮素的溶出。

2.8PHL-PC的经皮渗透性考察

2.8.1离体鼠皮的制备

大鼠处死，腹部脱毛后取皮肤，去除皮下组织和脂肪，选取无破损皮肤浸泡于生理盐水中，4℃冰箱保存备用。实验前仔细检查鼠皮是否损伤，以确保皮肤完整性。

2.8.2药物溶液的制备

称取等量的根皮素和PHL-PC（以根皮素含量计），溶解于pH7.4的PBS介质中，制成2mg/mL的供试液，用于透皮实验。

2.8.3皮肤渗透实验

使用Franz扩散池研究PHL-PC的体外皮肤渗透。大鼠皮水平放置，角质层面向供给池，真皮层面向接收池。以pH7.4的PBS为接收介质，在接收室内加入磁子持续磁力搅拌24h以确保药物分散均匀，将扩散池置于恒温磁力搅拌器上，固定转速350r/min,37℃水浴加热，平衡30min。将供试液（1mL）分别添加到各供给池内，并用封口膜覆盖，以避免蒸发。在0.5、1、2、4、6、8、10、12、24h吸取0.5mL的接收液，同时补充等量的新鲜接收液。精密吸取100μL接收液，加200μL甲醇，4000r/min离心10min，取上清液0.22μm微孔滤膜滤过，按“2.2.1”项下方法测定峰面积，计算接收液中根皮素含量，并根据下式计算累积渗透量（Qn）。

Cn、Ci分别代表接收介质中第n、i时测得的根皮素质量浓度，A为有效扩散面积（0.785cm2),V和Vi分别代表接收池体积（15mL）和取样体积（0.5mL)

根皮素和PHL-PC的经皮渗透曲线如图8所示，24h后，根皮素和复合物的Qn分别为16.97、35.02μg/cm2。结果表明制成磷脂复合物显著提高了根皮素在皮肤中的Qn，改善经皮渗透性能。

2.9药动学研究

2.9.1分析方法的建立

(1）色谱条件：同“2.2.1”项下。

(2）标准工作液的配制：精密称取根皮素对照品10mg，置于100mL棕色量瓶中，甲醇定容至刻度，制备100μg/mL的根皮素对照品溶液，4℃保存备用。

(3）系列标准溶液的制备：将“2.9.2”项下的标准工作液加入空白血浆逐级稀释，使得根皮素终浓度为10000、5000、1000、500、250、50、25、5ng/mL。4℃保存备用。

(4）专属性：通过比较空白血浆、根皮素标准工作液及血浆样品的谱图，发现血浆对根皮素的检测未发生干扰，结果如图9所示，表明该方法的专属性良好。

(5）线性关系考察：取“2.9.3”项下系列标准溶液200μL，加入600μL甲醇涡旋混匀，离心吸取上清液，0.22μm微孔滤膜滤过，按“2.9.1”项下方法测定，以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，得回归方程为Y=7.5405X+635.79,r=0.9998。结果表明，根皮素在25～10000ng/mL，质量浓度与峰面积具有良好的线性关系。

(6）精密度试验：取低、中、高质量浓度的质控样品（50、500、5000ng/mL），分别测定日内和日间精密度，计算得日内RSD均<1.71%，日间RSD均<6.03%，表明根皮素在所测范围内精密度良好。

(7）提取回收率与基质效应：低、中、高质量浓度（50、500、5000ng/mL）样品的基质效应分别为92.68%、92.44%、94.05%,RSD值分别为5.24%、6.46%、5.31%；提取回收率分别为89.77%、88.99%、87.25%,RSD值分别为5.21%、6.47%、5.54%。基质效应均>90%，提取回收率均>80%，表明该方法符合生物样品检测要求。

2.9.2经皮给药供试品制备

精密称取一定量等量的根皮素和PHL-PC粉末，分别加入PBS重新分散后，加入适量的卡波姆934，使卡波姆最终含量为1%，磁力搅拌溶胀过夜使成凝胶状，即得。

2.9.3药动学实验

SD雄性大鼠实验前禁食12h，自由饮水。随机分为2组，每组6只，分别为根皮素组和PHL-PC组。大鼠背部脱毛面积为5cm×5cm，一组涂抹根皮素凝胶，另一组涂抹等剂量的PHL-PC凝胶（100mg/kg，以根皮素含量计）。给药后于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24h眼眶采血，置于肝素钠抗凝离心管中。高速冷冻离心15min(13500r/min、4℃），吸取上清血浆，-20℃保存备用。

2.9.4血浆样品的处理

精密吸取血浆样品200μL，加入600μL甲醇沉淀蛋白，涡旋混匀后，13500r/min离心15min。吸取上清液0.22μm微孔滤膜滤过，按“2.9.1”项下色谱条件测定峰面积。

2.9.5实验结果

药-时曲线见图10，采用DAS3.2药动学软件计算药动学参数结果见表6。结果显示，与根皮素相比，复合物的Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P<0.05),t1/2与tmax延长，但无统计学意义（P>0.05）。与根皮素相比，复合物的AUC0～∞为12.07μg·h/mL，是根皮素的2.15倍，表明制成磷脂复合物后不仅延长了药物作用时间且显著提高根皮素的生物利用度。

3、讨论

实验室前期对复合溶剂、药脂比、药物浓度、复合时间及复合温度进行了单因素考察，最终筛选出对复合率影响最大的3个因素：药脂比、药物浓度和复合温度进行Box-Behnken响应面法分析优化最佳制备工艺条件。在制备过程中发现，乙醇作为反应溶剂的复合率较高且具有无毒、成本低等优点；反应温度在55℃复合率最高，60℃时复合率有所下降，这可能与磷脂在60℃以上不稳定、易氧化有关；随着药脂比和药物浓度的增大，复合率呈先增高再降低，这可能是由于随着磷脂用量或药物浓度的增大，溶液呈现过饱和状态，复合率又下降[11,12]。接着，为了考察各因素之间交互作用对复合率的影响，通过最少的实验次数精准获取因素与效应之间的关系，采用Box-Behnken响应面法进行优化。优选的制备工艺为药脂比为1.6∶1、药物质量浓度为1.7mg/mL、反应温度为56℃。

通过SEM、DSC、XRD和FT-IR对PHL-PC进行表征，发现复合物中并未形成新的化学键，磷脂复合物的形成是由于根皮素分子与磷脂的极性末端存在弱的分子间作用力所致，根皮素以无定形状态分散于复合物中。无定形状态是一种高能无序状态，具有溶解度高和溶出速率快的优点，通常用来改善药物溶解性，提高生物利用度[13]。本实验根皮素制成磷脂复合物后，根皮素在水和正辛醇中的溶解度得到了改善，生物利用度提高。

药物经皮渗透经过2个阶段，首先通过角质层，再经活性表皮层继而被吸收。角质层为亲脂性，脂溶性药物易通过；活性表皮层为水性组织，水溶性药物易透过，因此，药物既需要有一定脂溶性又需要一定水溶性才能用于经皮渗透[14,15]。油水分配系数（lgP）作为药物理化性质和渗透性的重要参数，在药物透过生物膜过程中具有关键作用，lgP值越大，说明该物质越亲油，反之，越小，则越亲水，即水溶性越好[16]。一般认为，lgP<-2，化合物为亲水性，不能穿过脂质膜；lgP>3，化合物因脂溶性太强而难以从细胞膜一侧释放出来。有文献表明[17]，药物透皮给药的最佳lgP值为2～3。根皮素制成磷脂复合物后，lgP值由1.22增加到2.03，显著改善了根皮素的脂溶性。经皮渗透实验结果表明将根皮素制成磷脂复合物既提高水溶性又提高脂溶性，显著增加其累积透皮吸收量。

根皮素由于具有较强的抗氧化、抗衰老作用，在药品及化妆品领域具有广泛的应用前景。查阅文献发现目前根皮素经皮给药制剂主要有根皮素微乳及微乳凝胶剂[18]等，但是发现其研究大多为制备工艺，未见经皮渗透及药动学特征的相关研究。凝胶剂具有生物相容性好、黏附性好及对皮肤和黏膜无刺激性且易于经皮给药的优点[19]，因此，实验中将根皮素和PHL-PC制成凝胶剂经皮给药，对比研究其药动学特性。药动学研究结果显示，与根皮素相比，制成磷脂复合物可以显著提高其生物利用度。有关磷脂复合物是否为根皮素经皮给药的最佳载药形式，后续有必要进一步开展磷脂复合物与其他载药形式的比较研究，为今后开发根皮素经皮给药制剂提供实验依据。

文章来源：黄珊,翟秉涛,杨洁,邹俊波,程江雪,张小飞,史亚军,郭东艳.根皮素磷脂复合物的制备、表征及体内外溶出行为评价[J].中草药,2021,52(18):5543-5551.