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浅谈人参芸苔素内酯合成关键酶Pg90B/724B基因克隆和表达载体创建

2020-06-19 321 上传者：管理员

摘要：为阐明内酯合成关键酶Pg90B/724B基因在人参芸苔素内酯合成途径中的作用，本研究根据人参转录组数据中90B/724B开放阅读框序列分析设计特异引物，用PCR克隆基因，并命名为Pg90B/724B。克隆载体选用p MD-19T，经大肠杆菌DH5α转化，双酶切验证及测序确定目标序列正确；将目的基因与PRI-201-AN载体构建重组DNA pRI-201-AN-Pg90B/72B，电击法转化农杆菌LBA4404，经PCR扩增后、鉴定pRI-201-AN-Pg90B/72B成功转化农杆菌。本研究成功构建重组DNA pMD-19T-Pg90B/724B和pRI-201-AN-Pg90B/724B，为进一步深入研究人参多茎形态的形成机制提供科学依据。

关键词：
Pg90B/724B
人参
医药食品
植物激素
药用植物
载体构建
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人参(Panax ginseng C.A.Mey)为五加科药用植物，具有很强的滋补功效，在医药食品和化妆品行业广泛应用(李卫民和李永平,1992,中国中药杂志,17(5):312-314)。随着市场对优质人参需求的增加，人参新品种的培育和开发越发重要而紧迫。针对人参种植群体进行的植株形态与产量关系调查时发现，单茎植株(仅1个茎)4年生人参平均干重为10.42 g/支，双茎植株(有2个茎)平均干重11.02 g/支，三茎植株(有3个茎)平均干重11.68 g/支(随机取样,取10株人参样本平均值)。多茎人参与单茎人参相比干物质量增加5%以上。可见，多茎形态人参在产量上优于单茎形态植株，符合人参育种目标和生产的要求。本研究在植株无损伤情况下，对人参多茎的形成机制进行了探究。

植物激素对植物形态建成及生长起重要调控作用，除生长素、细胞分裂素、赤霉素外，广泛存在于植物中。油菜素甾醇类物质(brassionsterinds,BRs)在植物生长控制、次生代谢及胚胎后期发育中起重要作用(Jin et al.,2006;孙超和黎家,2017)。BRs在植物的茎、叶、花等器官中均有分布。研究表明，芸苔素内酯(brassinolide,BL)对植物的表型具有较大的影响，参与植物许多生理变化过程，包括细胞伸长、细胞分裂、衰老、维管分化、繁殖、光形态建成以及各种环境因素的反应(Corvalán and Choe,2017)。有报道表明，BL对水稻的分蘖有影响(Tong et al.,2010)，而人参中有关油菜素内酯生理作用的研究至今没有报道。

植物中BRs的含量与BL合成基因的表达有关(刘燕等,2018)。DWF4是拟南芥BL合成途径的关键限速酶，决定BRs的浓度。分析人参转录组数据发现，DWF4同源基因90B/724B基因在2种形态人参中表达量有显著差异。为探究差异表达与植株形态差异存在的相关性，本研究对人参Pg90B/724B基因功能进行试验，阐明了人参Pg90B/724B基因克隆及转化重组子构建，为该基因功能研究提供科学依据，这是首次对人参中DWF4同源基因Pg90B/724B的报道。人参Pg90B/724B基因功能确定后，将成为人参分子育种的潜在候选基因。

1、结果与分析

1.1 Pg90B/724B基因相对表达量验证

从人参转录组数据可知：通过对照组单茎形态和实验组多茎形态人参中Pg90B/724B基因相对表达量比对(图1A)，并利用qRT-PCR法对Pg90B/724B基因表达量进行验证(图1B)，结果表明，基因相对表达量验证结果与测序数据趋势一致。

1.2 Pg90B/724B基因生物信息学分析

利用NCBI数据库中BLAST工具进行碱基序列同源性分析并构建进化树(图2)，该基因与DWF4等基因的同源性均在75%以上，属于细胞色素P450家族基因。通过ORF Finder分析，得到6个开放阅读框，其中，长度为753 bp的开放阅读框可编码251个氨基酸，起始密码子为：ATG，终止密码子为：TGA。

图1 Pg90B/724B相对表达量

图2 Pg90B/724B基因系统进化树

利用ExPASy在线分析可知，Pg90B/724B蛋白分子量为29 129.52 kD,分子式为C1294H2064N368O375S11，理论等电点为9.11，带负电荷残基总数(Asp+Glu):33，带正电荷残基总数(Arg+Lys):38，不稳定指数为46.63，脂肪酸指数为：87.77，亲水性平均数为：-0.429，没有明显的亲水疏水性区域。在肽链中，亮氨酸数量最多，占12%，半胱氨酸数量最少，只占0.8%。通过SMARTBLAST比对分析，显示该基因属于细胞色素P450家族。

1.3 Pg90B/724B基因亚克隆

基于NCBI ORF Finder得到长度为753 bp开放阅读框，根据载体上多克隆位点限制性内切酶位置，在5'端加NdeⅠ、3'端加SalⅠ设计引物，进行PCR扩增得到目的片段(图3A)，构建克隆载体，获得重组DNA pMD19-T-Pg90B/724B。经双酶切鉴定(图3B)，经(上海生工生物科技有限公司)测序，结果片段长度与目的序列一致。

1.4 Pg90B/724B植物表达载体构建

将植物表达载体pRI-201-AN与pMD19-T-Pg-90B/724B重组DNA同时用NdeⅠ和SalⅠ双酶切进行连接后转化E.coli DH5α，提取阳性克隆质粒DNA，进行双酶切(PstⅠ和SacⅠ)验证，片段长度和连接方向正确，DNA片段测序结果与转录组数据库中序列一致，表明重组子构建完成(图4)。

1.5 pRI-201-AN-Pg90B/724B转化农杆菌LBA4404

将重组子电击法转化农杆菌LBA4404，在筛选培养基上，随机挑取5个阳性克隆，150 r/min培养48 h得到菌液，利用SanPrep柱式质粒DNA抽提试剂盒提取质粒DNA，进行PCR验证电泳分析(图5),5个阳性克隆均获得长度750 bp左右的PCR产物，表明已获得转化的LBA4404。

图3 Pg90B/724B PCR产物及pMD19-T-Pg90B/724B双酶切验证

图4 pRI-201-AN-Pg90B/724B双酶切产物电泳分析

2、讨论

本研究对筛选人参转录组数据库DEG、KEGG获得的基因90B/724B进行克隆，构建完成了植物表达载体pRI-201-Pg90B/724B，用电击法转化农杆菌LBA4404细胞，经抗生素筛选及分子鉴定证明，阳性克隆中目的片段长度和序列正确，可用于进一步的基因功能研究。人参Pg90B/724B基因是拟南芥DWF4基因的同源基因，是芸苔素内酯BL合成途径的关键酶基因。

关于人参的研究，多见于活性成分、药理作用、光合生理特性、栽培技术研究等，对人参形态形成及植物激素的调控作用、基因及功能研究少有报道。本研究首次克隆了人参Pg90B/724B基因，是对人参芸苔素内酯BL合成途径中关键酶基因的首次报道。

油菜素甾醇类物质广泛存在于植物中，在植物生长发育几乎所有的过程中起重要调控作用(李涛涛等,2016)，并与生长素、赤霉素、脱落酸等激素相互作用影响植物生理过程。芸苔素内酯(油菜素内酯BL)是BRs中活性最强的一种分子。BL对植物形态发生及发育进程有重要作用，提高植物抗逆性及增加作物产量。BR合成的调节主要在合成基因转录水平上进行，其转录水平与内源BR浓度成正相关(Shimada et al.,2003)，而合成基因的表达水平受BR反馈抑制，合成途径中编码限速酶的DWF4、CPD等基因受BR信号途径反馈抑制(Sun et al.,2010),DWF4基因表达还受生长素和TCP1、BRX、CESTA等转录因子调控(Chung et al.,2011;Yoshimitsu et al.,2011)。拟南芥、胡杨等植物中DWF4基因研究表明，该基因过表达使拟南芥莲座叶变得细长卷曲，主茎高度增加，果荚变长，种子在盐胁迫下的萌发率提高，即影响植物生长及抗性(Jang et al.,2000)。那么，Pg90B/724B基因对四倍体植物人参的形态建成、生长及抗性影响如何需要研究确认。

图5 PCR法验证转化的LBA4404

Note:M:DL2000 DNA Marker;1～5:PCR product of pRI-201-Pg90B/724B plasmid DNA

本研究用基因克隆方法构建的植物表达载体pRI-201-Pg90B/724B，用于对该基因功能的进一步研究，以阐明其在人参形态特别是越冬芽发育形成多茎中的作用。该研究可能为借助分子育种手段培育优质高产人参品种提供候选基因。人参分子育种研究应更多借助于对拟南芥基础研究成果，加快对人参功能基因研究，以促进人参分子育种研究工作。

3、材料与方法

3.1试验材料

2015年7月下旬人参越冬芽发育生长初期，在中国吉林省集安市人参种植场取得“二马牙”类型4年生人参样本，经液氮处理，于-80℃冰箱冻存备用。本研究以单茎人参为对照组，多茎人参为实验组。

3.2载体及菌株

克隆载体：pMD19-T(TaKaRa,6013)，植物表达载体：PRI-201-AN(TaKaRa,3264)。

菌株：大肠杆菌DH5α(Sangonbiotech,B528411)，农杆菌LBA4404(TaKaRa,9115)。

3.3试验试剂

RNA提取试剂盒(TIANGEN,DP121221),c DNA合成试剂盒(B532435)、质粒小提试剂盒(B518191)、DNA凝胶回收试剂盒(B518131)、miRNA荧光定量PCR试剂盒(B532461)购于上海生工生物工程股份有限公司；DNA聚合酶、DNA连接酶、限制性内切酶、琼脂糖等购自宝日医生物技术有限公司。无水乙醇、异戊醇、苯酚、氯仿、冰醋酸等试剂均购于北京化工。

3.4试验仪器

高速冷冻离心机(Eppendorf)、Gene Amp PCR System 9700仪(ABI)、实时荧光定量PCR仪(ABI)、DYY-6C型电泳仪(北京市六一仪器厂)、凝胶成像系统(Analytik jena)、立式蒸汽灭菌锅(上海博讯医疗生物仪器股份有限公司)、移液枪(Eppendorf)、空气恒温摇床(上海新苗医疗器械制造有限公司)、生化培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)、MicroPulser电穿孔仪(Bio-rad)。

3.5 Pg90B/724B基因生物信息学分析

基于转录组数据所得Pg90B/724B碱基序列，通过NCBI数据库中的BLAST比对进行碱基同源性分析；用NCBI的ORF Finder进行Pg90B/724B开放阅读框分析；用ExPASy在线分析Pg90B/724B蛋白质理化性质。

3.6 Pg90B/724B基因片段克隆

根据RNAprep Pure Plant Kit对人参越冬芽进行总RNA提取，后反转成cDNA，以此为模板进行PCR扩增(95℃5 min;95℃45 s;55℃30 s;72℃45 s,35个循环;72℃4 min)，获得目的条带。通过APE软件进行引物设计：上游引物：5'-GGAATTCCATATG CATGCACAGAGAT-3'，下游引物：5'-GCGTGTCG ACTCATACCCTTTGTACCG-3'。利用DNA胶回收试剂盒回收目的片段，16℃30 min连接pMD19-T克隆载体(载体∶目的DNA=1∶4)，经过转化双酶切鉴定得到阳性菌落后送上海生工生物有限公司进行测序。

3.7 Pg90B/724B基因表达载体构建

以pRI-201-AN为表达载体构建重组质粒，将pMD19-T-Pg90B/724B与pRI-201-AN同时进行NdeⅠ和SalⅠ双酶切后进行凝胶电泳切胶回收目的片段，将回收的目的片段按1∶4的比例用T4连接酶过夜连接，经转化双酶切鉴定后由上海生工生物有限公司进行测序。

3.8农杆菌转化pRI-201-AN-Pg90B/724B

农杆菌LBA4404:pRI-201-Pg90B/724B DNA=20∶1混合，使用MicroPulser，使用Agr模式进行电击转化，取出电转杯，添加500μL SOC培养基，移入1.5 mL的离心管中30℃振荡培养1 h(100 r/min)。将50μL、100μL的细胞涂于含有50μg/m L卡那霉素的和100μg/mL链霉素的LB平板，30℃保温48 h。将得到的单克隆进行质粒PCR验证。

参考文献：

[1]李涛涛,高永峰,马瑄,陈永富,王阳,马金彪,2016,外源油菜素内酯对三种杨树在干旱、盐和铜胁迫下光合生理的影响,基因组学与应用生物学,35(1):218-226.

[2]孙超,黎家,2017,油菜素甾醇类激素的生物合成、代谢及信号转导,植物生理学报,53(3):291-307.

[3]刘燕,李涛涛,李琴中,刘小凤,高永峰,2018,胡杨油菜素内酯信号转导基因PeBZR1的克隆及诱导表达分析,基因组学与应用生物学,37(4):1576-1581.

赵露,周新芳,李俊,苑雪琪,朱雅静,邹季,张建勋,许永华.人参芸苔素内酯合成关键酶Pg90B/724B基因克隆及其表达载体构建[J].分子植物育种,2020,18(12):3932-3936.

基金:吉林省科技厅自然科学基金项目(20170101056JC);吉林省科技发展计划项目(20190304023YY);吉林省重点科技研发项目(20180201006YY)共同资助.