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鉴定分析黄心中华猕猴桃多倍体诱导

2020-06-19 745 上传者：管理员

摘要：中华猕猴桃因其拥有独特的风味、肉色和高维生素C，很受消费者的欢迎，具有很好的开发价值和市场前景。通过多倍体诱导，可促进中华猕猴桃种质改良。本研究对中华猕猴桃‘Hort16A’开放授粉后代优良单株‘SWFU02’的愈伤组织，使用秋水仙碱混培法与浸渍法分别进行诱导，并以形态学、气孔、染色体测定方法进行鉴定。结果表明：混培法中处理组合5 (168 h的处理时间和0.15%的秋水仙碱)的诱导率最大为20%；浸渍法中处理组合5 (36 h的处理时间和0.15%的秋水仙碱)的诱导率最大为6.67%。使用混培法诱导率显著大于浸渍法诱导率(20%>6.67%)。本研究为培育中华猕猴桃新种质提供了技术方法与科学依据。

关键词：
中华猕猴桃
倍性鉴定
南方果树
浸渍法
混培法
秋水仙素
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商业种植猕猴桃(Actinidia chinensis)从二十世纪中期开始，仅几十年就已经占据世界鲜果产量的0.25%以上(Cheng et al.,2004)；目前，中华猕猴桃‘Hort16A’是猕猴桃栽植的主要品种之一。由于对猕猴桃矮化选育和长代循环，倍性变异等使得中华猕猴桃‘Hort16A’出现了抗逆性差、易感病虫害等问题。目前，市场上的六倍体的美味猕猴桃品种‘秦美’、‘海沃德’相比于普通中华猕猴桃品种具有果实大、货架期长、耐贮藏、抗逆性强的特性(刘丽等,2017)。

多倍体天然和人工育种已经成为植物进化过程中一个显著的驱动力，这使其与与父母本相比，具有更广适应性和更高潜力的新的种群的建立(Wu et al.,2012)。改变植物倍性的方法之一是通过使用破坏有丝分裂的抗有丝分裂剂秋水仙碱，进行体外染色体加倍。目前，有关中华猕猴桃多倍体方面的研究并不多见。多倍体鉴定的方法主要有形态学鉴定、气孔鉴定、染色体鉴定，其中，能直接观察染色体数的染色体法最具有说服力。

为了在选育改良猕猴桃新品种，对黄心中华猕猴桃‘Hort16A’开放授粉后代优良单株‘SWFU02’的愈伤组织叶片进行多倍体诱导及鉴定。本研究使用浸渍法和混培法探讨进行多倍体诱导，对获得高诱导率的多倍体黄心中华猕猴桃的方法进行探讨，并对培育出的多倍体种质进行鉴定，旨在获得黄心中华猕猴桃多倍体种质，为黄心中华猕猴桃的种质改良、开发利用提供依据。

1、结果与分析

1.1多倍体诱导

在光照处理40 d后，对愈伤组织进行不同方法的诱导处理，得到了多倍体(图1)，并统计得到死亡数和诱变率(表1)。

处理组合间的方差分析结果，9个处理组合间的诱变率呈现极显著地的差异(p=0.004<0.01)

通过对不同诱导方法结果对比：混培法愈伤组织死亡数区间为最大为8个，浸渍法愈伤组织死亡数最大为16个；混培法诱变率最大为20.00%，浸渍法诱变率最大为6.67%(图2)。结果表明使用混培法处理愈伤组织的效果优于使用浸渍法处理愈伤组织。

1.2多倍体鉴定

诱导后的中华猕猴桃植株在培养基上继续增殖培养，生长一段时间后，对诱导得出的多倍体和普通二倍体的组培苗的形态学差异进行比较(表2)。

图1二倍体和所诱导的多倍体

表1诱导方法结果对比

二倍体中华猕猴桃的叶脉粗细、叶片厚度和气孔大小均极显著(p<0.01)小于多倍体中华猕猴桃，且多倍体中华猕猴桃的均值基本为二倍体中华猕猴桃的二倍。

测量二倍体与多倍体的气孔长直径，取平均值。结果显示，与二倍体比较，多倍体中华猕猴桃的气孔长直径明显呈倍数增大(表2)；二倍体的气孔趋于圆形，多倍体的气孔趋于椭圆形(图3)，且同等面积上，多倍体气孔数增加，面积增大。

表型异常的类型中，叶片厚度、叶脉粗细的植株经染色体鉴定的多倍体，可作为初步判断多倍体的表型指标。在固定时间24 h，染色时间13 min，解离时间10 min的条件下，染色体成功根数的均值为9.67根。中华猕猴桃二倍体染色体数目为2n=2X=58，四倍体植株的染色体数为2n=4X=116。结果观察到利用秋水仙碱诱导的植株染色体数为116条，为四倍体植株(图4)。

图2不同诱导方法诱导率对比

2、讨论

自然的多倍体植株数量十分稀少，不能为多倍体的育种提供更多遗传材料。所以，多倍体育种大多数采用人工诱导。常规的人工诱导多倍体的方法分别是物理诱变法和化学诱变法两种。秦金山等(1985)通过低温培育未授粉的子房获得了枸杞的四倍体。郑学勤等(1983,热带作物研究,(3):1-4)使用射线辐射的方法诱变橡胶得到多倍体橡胶。物理法确实可以得到多倍体，但是物理法的过程繁琐，得到多倍体的效率低、难于控制，所以一般采用化学法进行多倍体诱导。

本研究诱导多倍体的方法属于化学诱导法。最常用的化学试剂诱导多倍体包括秋水仙碱、异生长素。其中秋水仙碱最为有效，应用最广泛。随着植物组织培养技术的成熟发展，化学诱变与组织培养相结合，取得了良好的效果。赵学燕等(2009,农业与技术,29(1):44-47)使用秋水仙素成功诱导了白花泡桐；陈发棣等(2002)对菊花脑使用秋水仙素，成功诱导出多倍体；童俊等(2009)使用秋水仙素得到了多倍体紫薇，这表明使用秋水仙素进行人工诱导，在多次试验后，可得到避免嵌合体干扰的多倍体。

表2形态学鉴定对比

图3多倍体植株与二倍体植株差异

图4染色体差异

秋水仙素对植物本身具有一定毒性，其毒性会随着处理时间及浓度升高而毒性增强。混培法和浸渍法是秋水仙素诱导多倍体常用的两种方法。王娜等(2005)对酸枣和冬枣进行多倍体诱导得出混培法更适合丛芽多倍体诱导，诱变频率分别为36.67%和26.67%；李旦等(2017)对野生紫斑百合丛生芽使用不用方法进行多倍体诱导，发现混培法诱导率为46.67%，浸渍法诱导率为10.0%；郑君强等(2005,福建果树,(4):3-5)以四季桔进行多倍体诱导发现浸渍法得到诱导率为9.8%。多倍体诱导中，混培法诱导率明显优于浸渍法。

本研究使用不同的方法对二倍体猕猴桃愈伤组织进行诱导，其中混培法多倍体诱导率高于浸渍法多倍体诱导率，相比于浸渍法多倍体诱导率6.67%有了长足的进步(韩礼星等,果树学报,15(3):273-276)。秋水仙素能够与分裂期细胞中异二聚体相结合，阻碍纺锤丝的形成，使细胞染色体加倍(李悦和师尚礼,2016)。多倍体诱导的浸渍法采用愈伤组织直接浸泡入秋水仙素液体中，秋水仙素本身具有一定毒性，容易使植物的愈伤组织死亡，导致其诱导率变低。混培法将不同浓度的秋水仙素注入到培养基中，使秋水仙素未与愈伤组织直接接触，毒性降低。本研究的多倍体混培法的诱导率为20.00%明显优于浸渍法的诱导率6.67%。

在多倍体鉴定过程中，形态学鉴定是直接可用肉眼鉴别的方法，但准确率较低(黄丽芳等,2015)。目前，最具有证明力的鉴别方法是染色体法。通过染色体法，可以最直观观察植物细胞核中染色体条数。张静静(2013)用秋水仙素诱导铁皮石斛，得到其疑似四倍体，通过染色体计数法鉴定后发现其染色体条数为76条，二倍体染色体条数为38条；张海利等(2010,江苏农业科学,(4):40-41)对变异番茄植株通过染色体计数法进行倍性鉴定，发现其染色体数为36条，正常番茄二倍体的染色体数为24条，从而鉴定出此变异番茄植株为三倍体。本实验中，多倍体中华猕猴桃出现叶片厚度增加，叶脉粗度增大，叶面颜色变深、保卫细胞变大等现象，符合多倍体的巨大化特征(孙红梅等,2018)。中华猕猴桃‘SWFU02’二倍体染色体数目为2n=2X=58,四倍体植株的染色体数为2n=4X=116。观察到利用秋水仙碱诱导的植株染色体数为116条，为四倍体植株。有些染色体发生了重叠，这可能是由于敲片时受力不均一所导致的。且四倍体染色体的长短不一，这是由于染色体螺旋化程度不一所造成的。本试验成功诱导出中华猕猴桃多倍体，为以后的中华猕猴桃的新种质研究提供了理论基础和技术参考。

3、材料与方法

3.1试验材料

本研究以中华猕猴桃‘Hort16A’开放授粉后代优良单株‘SWFU02’经过组织培养得到的二倍体愈伤组织为材料，‘SWFU02’取样于西南林业大学猕猴桃种质资源圃。

3.2材料处理与检测

本研究采用多倍体诱导的混培法对黄心中华猕猴桃‘Hort16A’开放授粉后代优良单株‘SWFU02’的叶片愈伤组织进行多倍体诱导处理。将秋水仙素加入培养基中，设0.1%、0.15%、0.2%的秋水仙素浓度，再设120 h、168 h、240 h的处理时间，共9个处理组合。每瓶培养基放入3个材料，每个处理组合共30个材料。

对处于同一时期的‘SWFU02’的叶片愈伤组织使用多倍体诱导的浸渍法。将试验材料直接放入秋水仙素溶液中，设0.2%、0.35%、0.5%的秋水仙素浓度，再设24 h、36 h、48 h的处理时间，共9个处理组合。每瓶培养基放入3个材料，每个处理组合共30个材料。

随机选择30株诱导得到的多倍体和二倍体组培苗，使用游标卡尺叶脉粗细、叶片厚度进行测量，每个叶片测3次取平均值。

随机选取5片生长阶段一致的二倍体和多倍体猕猴桃组培苗叶片，制片后用显微镜分别观察其气孔情况。

对多倍体组培苗的根尖，采用固定时间24 h，染色时间13 min，解离时间10 min进行制片，再镜检观察以及拍照，在显微镜下观察染色体形态和计数，对典型分裂相细胞进行拍照记录。

作者贡献

魏卓是本研究的实验设计者和实验研究的执行人；魏卓完成数据分析，论文初稿的写作；张先昂、张越、刘小珍、叶琴霞及李贻沛参与实验设计，试验结果分析；张汉尧是项目的构思者及负责人，指导实验设计、数据分析、论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

参考文献：

[1]陈发棣,蒋甲福,房伟民,2002,秋水仙素诱导菊花脑多倍体的研究,上海农业学报,18(1):46-50.

[2]黄丽芳,殷绪明,杨宇晨,李伟丽,易自立,2015,野生南荻与芒杂种多倍体诱导研究,西北植物学报,35(1):50-56.

[3]李旦,罗一然,韩国伟,张雪,吴英英,何承中,2017,野生紫斑百合多倍体诱导研究,云南农业大学学报,32(4):678-684).

魏卓,张先昂,张越,刘小珍,叶琴霞,李贻沛,张汉尧.黄心中华猕猴桃多倍体诱导及鉴定[J].分子植物育种,2020,18(12):4036-4040.

基金:国家自然科学基金(31760450);云南省农业基础研究联合专项资金共同资助.