外泌体(exosomes)是细胞膜向外释放的杯状脂双层膜小泡(直径30～150 nm)[1,2]。最早由Pan B T[3]和 Johnston R M[4]在绵羊网织红细胞中发现并命名。外泌体广泛存在于各种体液及细胞培养液中，如尿液、血液、母乳、脑脊液、唾液、胆汁、腹水、眼泪、精液和羊水[5]。部分外泌体已被证明其性质类似于或反映了其母体来源[6]。因此，外泌体检测对肿瘤早期诊断、治疗及预后有着重要作用。

适配体(aptamer, Apt)是一种短的单链DNA或RNA分子，通过称为配体指数级进化富集(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)过程获得并浓缩[6,7],能以高亲和力和特异性识别靶标，被称为“化学抗体”。适配体存在可快速、重复合成、易修饰、长期稳定等特点，较易与基于核酸的检测技术相结合。利用适配体作为传感材料的生物传感器，即适配体传感器(aptasensor),在医疗和环境检测等领域发挥着重要作用。

本文主要介绍现阶段适配体筛选技术以及基于外泌体的适配体传感器的构建及应用，并讨论基于外泌体的适配体在目前临床环境应用中的局限性。

1、适配体筛选技术

传统SELEX是一种体外筛选核酸适配体的基本技术，1990年由Tuerk C和Gold L[7]以及Ellington A D和Szostak J W[8]的2个实验室独立开发。其原理是构建一个大容量的可包含多达60个随机碱基的单链寡核苷酸文库，其两侧是短恒定区，通常用于在聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)过程中退火延伸引物。反复进行多轮筛选，最后得到与靶标高特异性、高亲和力结合的核酸适配体，对潜在适配体进行测序，并评估其结合动力学。使用SELEX技术，可以从核酸文库中分离出对各种靶标具有高特异性和亲和力的适配体。传统SELEX是一种成熟、有效的方法，但由于其耗时耗力，更新适配体的筛选技术是不可避免的。下面介绍几种常用的适配体筛选技术。

1.1 磁珠—SELEX

1997年，Broun J G等人[9]发表了一种利用磁珠(magnetic bead, MB)固定靶标的SELEX方法。在此方法中，靶标被固定在磁珠上，与寡核苷酸文库一起孵育，产生靶标—适配体复合物，通过磁性分离器与未结合的寡核苷酸分离。基于磁性分离原理，Stoltenburg R等人[10]于2005年发表了一种更方便、更容易的FluMag-SELEX方法，以及通过固定DNA文库而建立的捕获—SELEX(Capture-SELEX)方法[11]。Song Z等人[12]通过使用基于磁珠的竞争性SELEX(MB-SELEX)和引入0.5 mol/L氯化钠(NaCl)作为洗脱缓冲液，筛选出2种外泌体蛋白CD63高亲和力和特异性的DNA适配体(CD63—1和CD63—2)(Kd分别为38.71 nmol/L和78.43 nmol/L)。

1.2 氧化石墨烯—SELEX

将靶标结合的单链DNA(single-stranded DNA,ssDNA)与非结合的ssDNA分离是成功筛选适配体的关键步骤。当涉及到小分子时，通常意味着对靶标进行化学修饰，然后固定在磁珠或琼脂糖珠等基质上[13,14]。但这种化学修饰可能改变靶标的固有结构，导致所选适配体的亲和力降低。

因此，出现不固定靶标的适配体筛选技术，Park J W等人[15]于2012年利用氧化石墨烯(graphene oxide, GO)与ssDNA的π-π堆积作用，将GO作为结合ssDNA与分离的介质，利用SELEX建立了GO-SELEX。首次实现了最具成本效益、简化、快速和无固定化的SELEX。GO-SELEX只需少于5轮SELEX便可获得具有高亲和力和特异性的适配体。更重要的是，可减少靶标的数量。Nguyen V T等人[16]同样利用GO构建了multi-GO-SELEX。GO-SELEX和multi-GO SELEX利用ssDNA吸附在GO上的特性将未结合的ssDNA从结合目标的ssDNA中分离出来。

1.3 毛细管电泳—SELEX

毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)-SELEX是最常用的SELEX方法之一，首次发表于2004年[17]。这种方法将适配体筛选的循环数从常规筛选的20个循环减少到4个循环，保持适配体与靶标的高亲和力。该方法是根据电泳迁移率将适配体—靶标复合物与未结合的寡核苷酸分离开来，与靶标结合的寡核苷酸比游离寡核苷酸具有更低的迁移率。这种方法筛选快速，只需要1～4轮筛选，且不需要固定靶标，减少了非特异性结合。但仅限于针对高分子量靶标的筛选，不适用于小分子的适配体筛选。

1.4 细胞—SELEX

与MB-SELEX与CE-SELEX方法不同的是，基于细胞的SELEX(Cell-SELEX)[18]的靶标是完整细胞。与传统SELEX一样，寡核苷酸文库与靶标一起孵育。洗去未结合的寡核苷酸，从靶标中分离适配体，进行PCR扩增。Cell-SELEX最常见的是8～10个循环，也可高达35个循环，以获得高亲和力的适配体。这种方法适用于细胞表面靶标，需要高水平的专业技术知识，代价高且耗时。Jia W等人[19]使用Cell-SELEX程序，成功筛选了区分鼻咽癌(nasopharynx cancer, NPC)细胞和正常鼻咽上皮细胞(nasopharyngeal epithelia, NP)之间差异的4种适配体(S3、S5、S12和S27)。

2、基于外泌体的适配体传感器的构建

生物传感器由传感器和生物识别元件组成，可提供快速分析和实时检测。适配体传感器是一种特殊类型的生物传感器，其中适配体作为生物识别元件可与特定目标结合。换能器将这种结合转换成可检测和可测量的信号。许多研究已证明适配体传感器在外泌体检测中的巨大潜力。

2.1 适配体传感器分类

基于适配体的信号转导方法，将适配体传感器分为八大类(如表1):荧光、电化学、比色、发光、侧流层析试纸条(lateral flow strip, LFS)、表面增强拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering, SERS)法、表面等离子体共振(surface plasmon resonance, SPR)传感器和巨磁电阻(giant magnetoresistance, GMR)传感器。这些适配体传感器具有快速、灵敏、高通量、无创或微创、液体活组织检查和经济高效的分析等诸多优势，并提供了小型化和便携式传感平台。

表1 适配体传感器分类及其应用策略分析

2.2 荧光适配体传感器

荧光适配体传感器具有操作简便、灵敏度高、信号强等优点，通常依赖于荧光基团、染料和荧光纳米粒子的使用，是目前外泌体检测中使用最为广泛的技术。该适配体传感器主要采用3种策略：荧光信号放大(fluorescence signal amplification, FSA)、荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)和荧光偏振(fluorescence polarization, FP)。

2.2.1 FSA

适配体是核酸的基本类型，因此，它可与各种基于DNA的FSA反应结合，以提高检测灵敏度。这些反应包括滚环扩增(rolling circle amplification, RCA)、杂交链式反应(hybridi-zation chain reaction, HCR)、发夹DNA级联杂交反应(hair DNA cascade hybridization reation, HD-CHR)和链置换反应(strand displacement reaction, SDR)。其中，RCA产生大量的核酸产物，实现信号放大。含有核仁素和RCA引物的DNA探针可以结合外泌体并引发RCA,产生增强的荧光信号[20]。

2.2.2 FRET

在3′—或5′—末端使用荧光基团或淬灭剂染料修饰适配体，不影响靶向结合，基于距离依赖性荧光淬灭的FRET适配体传感器由此产生。在外泌体检测中使用了两种类型的FRET:荧光基团—淬灭剂和荧光基团—纳米粒子。在“荧光基团—淬灭剂”适配体传感器中，游离适配体是发夹结构，荧光基团(如四甲基罗丹明，TAMRA)和适配体两端修饰的淬灭剂(Dabcyl)距离较近，对荧光有淬灭作用[36]。外泌体的存在打开了发夹结构，导致TAMRA和Dabcyl的分离，使TAMRA发出强烈的荧光。该方法为外泌体检测提供了一种简单快速的方法。Zhang Q等人[21]基于适配体/Ti3C2 MXenes纳米复合体构建了一种独特的标准开启式FRET适配体传感器，外泌体的检测限为1.4粒子/μL,比常规酶联免疫吸附法低1 000倍以上。

2.2.3 FP

FP是一种比率测量方法，对样品的荧光波动和光漂白不敏感，不需要淬灭剂或供体受体对，简化了探针设计。Zhang Z等人[22]构建了一种用于外泌体检测的FP适配体传感器。当染料标记的适配体(平均10 kDa)(1 Da=1 g/mol)与外泌体(3.3×104 kDa)结合时，适配体的FP值由于外泌体/适配体复合物的巨大质量而显著增加。这种无分离、无扩增的方法受环境干扰的影响较小，只需一个混合读取步骤(约30 min),即可在人血浆(～1 μL)中实现灵敏定量。这种传感器对小肺癌细胞系衍生的外泌体的最低检测限为500粒子/μL。

2.3 电化学适配体传感器

在电化学适配体传感器中，适配体作为生物识别元件被结合并集成在电化学传感器表面，当与靶标结合时产生电信号。这种适配体传感器具有高灵敏度检测、低成本、仪器简单、自动设置等显著特点，能够出色应用到临床环境中。在电化学适配体传感器的构建中，主要采用4种方法：直接固定法、夹心法、DNA步行机器人和免固定法。

2.3.1 直接固定法

在大多数情况下，适配体探针直接固定在电极表面，作为电化学方法中的亲和传感器。Wang S等人[23]提出了一种使用基于适配体的纳米四面体结构来直接捕获外泌体的增强型电化学适配体传感器。根据硫醇和金(Au)电极之间的相互作用固定的底部金字塔结构中，每个适配体链以限定的纳米(nm)级距离分布，可以降低阻碍效应、保持空间定向。

2.3.2 夹心法

适配体对外泌体的识别和结合效率在溶液—电极界面上普遍较低，限制了检测灵敏度。基于“捕获探针—外泌体—检测探针”格式的夹心式适配体传感器通常用于提高识别率。为放大信号，An Y等人[2]基于CD63适配体和外泌体的特异性识别、炔基—4—酮分子功能化脂质亲电体的非特异性识别，结合点击化学和放大，构建了一种新型三明治结构的“炔基—4—酮/外泌体/CD63适配体”适配体传感器。由于点击化学和HCR技术的有效性，可达到低至96粒子/μL的检测限，在人血清中也实现了外泌体的定量。

2.3.3 DNA步行机器人

为提高灵敏度，DNA步行机器人的3D折叠结构结合电化学方法用于检测外泌体。这种步行机器人沿着由脱氧核酶或软件无线电驱动的设计好的寡核苷酸轨道独立移动，这种寡核苷酸轨道可以将外泌体捕获转换为ssDNA检测。基于此，Dong H等人[24]开发了双信号扩增DNA步行机器人。适配体—MB生物偶联物用于捕获外泌体，导致3个信使DNA释放，然后与固定在Au电极上的探针P1杂交形成双链结构。最低检测限可达70粒子/μL。DNA循环扩增技术和电化学检测方法的优势被完全整合到DNA步行机器人中，这可能会推动液体活检技术的广泛发展。

2.3.4 免固定法

为避免将适配体固定到电极表面的这一耗时过程，Yin X等人[25]基于蒽环类药物阿霉素和Exo Ⅲ辅助扩增，开发了一种免固定化电化学传感平台。在该传感器中，CD63适配体识别并与外泌体结合，并从双链DNA探针中释放出P2探针。随后，将P2探针与另一种富含气相色谱的幽门螺杆菌探针杂交，并引发Exo Ⅲ切割过程，最终导致溶液中残留的幽门螺杆菌探针减少。阿霉素可以与双链气相色谱序列强结合，产生巨大的电流信号，最低检测限为12粒子/μL。

2.4 比色传感器

比色适配体传感器能够通过目视检查“是/否”来读取结果，无需复杂的传感设备即可轻松完成，并且检测成本低、速度快、简单。主要采用3种策略：NaCl诱导的Au纳米颗粒(Au nanoparticles, AuNPs)聚集、H2O2氧化反应和AuNPs金属化。

2.4.1 NaCl诱导的AuNPs聚集

在寡核苷酸适配体传感器中，适配体可与寡核苷酸表面结合，在高盐浓度下可以防止聚集。外泌体存在的情况下，适配体离开AuNPs表面与外泌体蛋白结合，从而诱导AuNPs聚集，颜色从红色变为蓝色。Jiang Y等人[26]采用这种策略构建可以在几分钟内肉眼区别外泌体表面蛋白的传感器平台，为外泌体检测提供了潜在的参考。

2.4.2 H2O2氧化反应

在H2O2氧化反应中，纳米酶因其固有的酶模拟活性而受到越来越多的关注。此外，一些纳米酶能吸附适配体，纳米酶—适配体复合物能显著增强过氧化物酶样活性。基于此，Wang Y M等人[27]设计了一种使用石墨氮化碳纳米片的比色传感器。适配体被非特异性吸附在纳米片表面，提高了至少4倍的过氧化物酶活性，从而增强了H2O2对四甲基联苯胺的氧化，并呈现出强烈的蓝色。外泌体从纳米片表面释放适配体，颜色变为无色。

2.4.3 AuNPs金属化

2019年，Zhang Y等人[28]开发了一种基于三明治结构的视觉传感器，该传感器集成扩增和酶诱导银(Ag)沉积在Au纳米棒(Au nanorods, AuNRs)上。首先，MB—CD63适配体用于捕获和富集外泌体，外泌体脂质膜非特异性插入胆固醇连接的DNA探针，然后触发HCR过程。大量HCR产物导致碱性磷酸酶的负荷增加，碱性磷酸酶催化Ag离子的还原，并促进Ag壳在AuNRs上的金属化及裸眼分析的多色变化，紫外可见光谱检测限低至1.6×102粒子/μL,肉眼检测限低至9×103粒子/μL,低于其他比色分析。

2.5 基于发光的适配体传感器

发光是一种物质在不发热的情况下发光的过程。因其具有高灵敏度、低成本和易于控制的特点，几种基于发光的适配体传感器被设计用于外泌体的检测。根据发光能量来源分为2个亚型：发光共振能量转移(luminescence resonance energy transfer, LRET)和电化学发光(electrochemiluminescence, ECL)。

2.5.1 LRET

基于LRET的传感器与FRET机制一样，具有灵敏度高、分辨率高、可操作性好等优点。Lyu Y等人[29]开发了绕过实时光激发用于多重区分癌症外泌体的发光纳米传感器，该传感器可以通过改变适配体序列来轻松检测不同的外泌体蛋白，因为检测发生在激发后，使背景信号最小化，提高了检测限，比细胞培养基中的荧光检测低近2个数量级。能够对多个外泌体样品进行正交分析，从而有可能准确识别外泌体的细胞来源。

2.5.2 ECL

与电化学分析不同，ECL策略避免了背景电流的干扰，不依赖于电极表面粗糙程度、温度、湿度、pH等外部因素。Fang D D等人[30]构建了一种基于GCE/适配体—外泌体—抗体/MXenes三明治的ECL适配体传感器，由黑磷量子点作为信号放大器和三(4,4—二羧基联吡啶)氯化钌[Ru(Dcbpy)]作为共反应器，产生了一个较强的ECL信号，37粒子/μL的强ECL信号。值得注意的是，该传感器也可以开发为一种用于外泌体检测的热转换装置。

2.6 LFS

LFS通常在平装便携式设备上进行，操作简单，通过颜色或信号变化很容易观察到结果。根据测试线的不同交互作用，LFS通常分为两种类型的夹层条或竞争条。Cheng N等人[31]设计了一种基于热信号的夹心条带用于外泌体检测。简而言之，Au@Pb纳米与外泌体一起孵育形成Au@Pb—外泌体复合物。用CD63适配体纳米花修饰测试线，能够捕获Au@Pb—外泌体复合物，并且由于纳米聚集体的积累以及通过激光激发的热信号而形成黑色带。外泌体未结合的纳米探针将在控制线与生物素标记的探针相互作用，显示另一条黑色条带。该方法的检测限可达1.4×104粒子/μL。

2.7 SERS

SERS具有用于筛选不同外泌体的独特指纹特征，并且具有窄的光谱带。Ning C F等人[32]报道了一种用于检测癌细胞培养物中外泌体的适配体传感器，该传感器基于编码在Au、Ag双金属纳米环上的不同拉曼信号报告(2—Mpy、4—ATP或NTP)和适配体修饰的MBs作为捕获底物。SERS方法能够通过一个步骤区分各种外泌体，可作为癌症诊断的潜在策略。

2.8 SPR传感器

SPR是一种光学生物传感方法，可用于实时跟踪自然界中金属表面上的生物分子相互作用。这种方法不会对生物分子造成任何损害，也不需要任何标记。Wang Q等人[33]将SPR适配体传感器用于双AuNPs辅助信号放大的外泌体检测。简而言之，CD63适配体被固定在Au膜表面以捕获一般的外泌体，包被在T30—AuNPs上的CD63适配体识别外泌体CD63蛋白，从而形成“Au膜/CD63适配体—外泌体—CD63适配体/T30—AuNPs”的三明治复合物，导致局部折射率发生变化，出现第一个SP单体。通过抗原—抗体相互作用加入A30包被的抗原，实现双重信号放大。该方法灵敏度高，最低检测限为5粒子/μL。

2.9 GMR

GMR因其与集成电路技术的兼容性以及与超顺磁性纳米粒子技术的高灵敏度在生物传感器应用获得极大关注。在此，Zhu F等人[34]基于MoS2—Fe3O4纳米结构的磁信号响应开发了一种用于外泌体检测的GMR适配体传感器(MOFE)。CD63适配体被修饰到GMR传感器表面，用于捕获一般的外泌体。该传感器的检出限为10粒子/μL,具有良好的重现性和选择性。这种GMR为外泌体检测提供了一种新方法，显示出在临床癌症鉴定方面的巨大潜力。

3、基于外泌体的适配体的应用

3.1 在肿瘤早期检测中的应用

外泌体因其特殊性质可以作为生物标志物来对肿瘤进行检测。因此，在人体体液内寻找和检测肿瘤细胞分泌的外泌体会是一种新颖、无创、高度可靠的诊断方式。这里介绍基于外泌体的适配体在几种常见肿瘤中的应用。

为高灵敏度检测乳腺癌外泌体，Wang Y等人[35]提出的基于稀土掺杂上转换纳米粒子(UCNPs)供体和四甲基罗丹明(TAMRA)受体之间的LRET的免洗适配体传感器，检测限低至80粒子/μL,为LRET传感器应用于临床提供了很好的数据支持。Huang R等人[37]介绍了一种用于胃癌外泌体特异性检测的无标记电化学适配体传感器。该适配体传感器对胃癌外泌体具有高选择性和敏感性，有望为早期胃癌检测提供有用的诊断工具。

3.2 在靶向治疗中的应用

外泌体是用于运输生物分子以促进细胞间通信的纳米级天然载体，表明它们在提供治疗具有很高的潜力。为提高外泌体的递送能力，人们发现一种简单、无创且有效的策略，用有效的靶向适配体功能化外泌体，外泌体可以保护体内的药物，使药物不易释放，减少对正常细胞的不良影响；适配体可以增加药物传递系统的靶向性，尤其是个体化治疗中的多重靶向适配体。Zou J等人[38]利用二酰基脂质—适配体缀合物作为靶向适配体来开发适配体功能化的外泌体(Apt-Exos)纳米平台，用于分子治疗的细胞类型特异性递送。详细研究了Apt-Exos的细胞摄取机制，与游离外泌体相比，观察到了不同的行为。Apt-Exos结合适配体优异的分子识别能力和外泌体作为天然载体的优势，可以有效地将分子药物/荧光基团靶向递送至癌细胞，为癌症治疗提供了一个有前景的递送平台。

4、讨论与展望

综上所述，本文综述了常用的适配体筛选方法，以及近年来适配体传感器在检测肿瘤外泌体及靶向药物传递的研究进展。适配体的独特性质使其成为适配体传感器制造、生物识别和信号转导的理想材料。结合电化学、发光及比色等灵活的技术，提高了检测外泌体的灵敏度。

近年来，关于外泌体及其适配体的研究报道越来越多，适配体传感器用于外泌体检测的研究表明适配体传感器的适用性，虽然目前没有以Apt-Exos为基础的应用，但不可否认这将为肿瘤的早期检测以及药物治疗提供新的发展方向。

尽管适配体已经在许多传感平台中得到应用，但仍有一些关键的技术问题和挑战需要改进或解决，比如基于外泌体的适配体传感器在临床实际样本中的利用、基于外泌体的适配体的筛选技术的改进与创新等。这一进步需要材料科学、分子和细胞生物学、化学、药学和临床医学等众多领域的研究人员共同不懈的努力。

基金资助:国家自然科学基金资助项目(81401757);四川省科技计划项目应用基础研究(2019YJ0367);四川省科技创新项目苗子工程项目(2019047);成都医学院校基金资助项目(CYZYB21—02);

文章来源:苏欣,朱彤,许晓寒思等.基于外泌体的适配体传感器的构建与应用[J].传感器与微系统,2024,43(01):1-6.