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甘草查尔酮A对人脑胶质瘤U87细胞增殖和侵袭的影响及机制研究

2023-07-20 49 上传者：管理员

摘要：研究甘草查尔酮A(LCA)对人脑胶质瘤U87细胞增殖和侵袭的影响及其分子机制。方法将体外培养的人脑胶质瘤U87细胞分为空白对照组(完全培养基)和低、中、高(5、10、20μ•mol•L-1 LCA)3个剂量实验组。用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测细胞增殖能力；用Transwell小室法检测细胞侵袭能力；用蛋白质印迹法检测细胞凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2同源拮抗剂(Bak)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和MMP-9蛋白表达水平。结果空白对照组和低、中、高3个剂量实验组细胞增殖活力分别为(98.15±2.31)%、(85.19±1.28)%、(72.66±2.03)%和(53.76±3.10)%;这4组穿膜细胞数百分比分别为(100.00±0)%、(70.61±4.54)%、(53.70±3.64)%和(35.27±5.09)%,这4组Bax蛋白表达水平分别为0.56±0.04、0.67±0.02、1.26±0.18和1.40±0.11;这4组Bak蛋白表达水平分别为0.45±0.01、0.63±0.08、0.89±0.06和1.03±0.10;这4组Bcl-2蛋白表达水平分别为0.98±0.06、0.71±0.04、0.65±0.02和0.30±0.01;这4组MMP-2蛋白表达水平分别为1.25±0.03、0.97±0.05、0.86±0.01和0.70±0.06;这4组MMP-9蛋白表达水平分别为1.18±0.02、0.90±0.04、0.72±0.05和0.65±0.01。上述指标，低、中和高3个剂量实验组与空白对照组比较，差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论 LCA对U87细胞的增殖和侵袭均具有抑制作用，其作用机制与调控Bcl-2、Bax和Bak的平衡，下调MMP-2和MMP-9的表达水平有关。

关键词：
侵袭
凋亡
增殖
甘草查尔酮A
胶质瘤
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脑胶质瘤是中枢神经系统发病率最高的恶性肿瘤，目前治疗方式主要以手术切除及放化疗为主，但是长期的药物化疗会引起严重的药物不良反应及诱导肿瘤耐药，新的治疗方法尤其是中药治疗具有重要意义[1,2,3]。甘草查尔酮A(licochalcone A, LCA)是从甘草根中提取出来的黄酮类化合物，是甘草的主要活性成分之一，具有多种药理学活性，包括抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗菌、抗寄生虫及成骨活性、免疫调节、解痉挛等多种药理活性，目前最受关注的是其抗肿瘤活性[4]。本研究旨在探讨LCA对人脑胶质瘤U87细胞增殖和侵袭的影响及其分子机制。

一、材料与方法

1、材料

细胞人脑胶质瘤细胞系U87,购自美国ATCC公司。

药品与试剂LCA,规格：每支20 mg,纯度：>98%,批号：C15A10M94486,购自上海源叶生物科技有限公司。细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)试剂盒，购自武汉博士德生物工程有限公司；B淋巴细胞瘤-2 (B cell lymphoma -2,Bcl-2)、Bcl-2同源拮抗剂(Bcl-2 homologous antagonist, Bak)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和MMP-9抗体，均购自沈阳万类生物科技有限公司。

仪器5417R台式高速离心机，德国Eppendorf生命科学公司产品；JYH27020电泳仪，美国Bio-Rad公司产品；ELX800酶标仪，美国Bio-Tek仪器公司产品。

2、实验方法

2.1细胞培养

U87细胞培养在含10%胎牛血清、含100 U·L-1青链霉素的DMEM培养基中，置于5%CO2、37℃恒温培养箱中，每隔2～3 d用0.25%胰蛋白酶进行消化传代。

2.2细胞分组和药物处置

将U87细胞分为空白对照组和低、中、高3个剂量实验组。空白对照组用完全培养基培养，3个剂量实验组分别使用5、10和20μmol·L-1 LCA的培养基培养。

2.3用CCK-8检测细胞增殖能力[4]4]

U87细胞按“2.2”进行处理，各组均培养48 h后，往每孔加入CCK -8溶液10μL,置于37℃、5% CO2的条件下孵育1 h,用酶标仪在450 nm波长处检测光密度(optical density, OD)值，计算细胞增殖活力= (OD实验组-OD空白组) /(OD对照组-OD空白组)×100%,实验重复3次。

2.4用Transwell小室法检测细胞侵袭能力[5]5]

将1 mg·mL-1基底胶Matrigel铺于Traswell小室中，37℃细胞培养箱中放置1 h。将U87细胞密度为1×105 cell·mL-1。取细胞悬液100μL接种于上层小室，并分组加入5、10和20μmol·L-1 LCA后将其置于24孔细胞培养板中，在下室加入完全培养液500μL,培养24 h。弃去上室培养液，多聚甲醛固定及结晶紫染色，在显微镜下计算穿膜细胞数。每室上、下、左、右、中各选取5个视野，显微镜下计数并拍照，取平均值，实验独立重复3次，分析细胞侵袭能力。

2.5以蛋白质印迹(Western blot)法检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bak、Bax、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平[4]4]

收集各组后细胞裂解，4℃下以1.2×104 r·min-1离心10 min。用二喹啉甲酸法进行蛋白定量，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离后电转移至聚偏二氟乙烯膜，孵育30 min,通过凝胶成像分析系统，以β-肌动蛋白(β-actin)为内参对照，计算各个样本目的蛋白条带与β-actin条带的灰度比值，作为目的蛋白的相对表达水平。

3、统计学处理

用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析。计量资料用x¯±s表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验。

二、结果

1 LCA对U87细胞增殖的影响

空白对照组用完全培养基培养，3个剂量实验组分别使用5、10和20μmol·L-1 LCA的培养基培养。CCK-8结果显示，空白对照组和低、中、高3个剂量实验组细胞增殖活力分别为(98.15±2.31)%、(85.19±1.28)%、(72.66±2.03)%和(53.76±3.10)%。低、中、高3个剂量实验组细胞增殖活力与空白对照组比较，差异均有统计学意义(均P<0.01)。

2 LCA对U87细胞侵袭的影响

空白对照组和低、中、高3个剂量实验组的穿膜细胞数百分比分别为(100. 00±0) %、(70.61±4.54)%、(53.70±3.64)%和(35.27±5.09)%。低、中、高剂量实验组的穿膜细胞数百分比与空白对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.01),结果见图1。

3 LCA对U87细胞Bax、Bak和Bcl-2蛋白表达水平的影响

空白对照组和低、中、高3个剂量实验组Bax蛋白表达水平分别为0.56±0.04、0.67±0.02、1.26±0.18和1.40±0.11;Bak蛋白表达水平分别为0.45±0.01、0.63±0.08、0.89±0.06和1.03±0.10; Bcl-2蛋白表达水平分别为0.98±0.06、0.71±0.04、0.65±0.02和0.30±0.01。低、中、高剂量实验组的Bax、Bak和Bcl-2蛋白表达水平与空白对照组比较，差异均有统计学意义(均P<0.01),结果见图2。

4、LCA对U87细胞MMP-2和MMP-9蛋白表达水平的影响

空白对照组和低、中、高3个剂量实验组MMP-2蛋白表达水平分别为1.25±0.03、0.97±0.05、0.86±0.01和0.70±0.06;MMP-9蛋白表达水平分别为1.18±0.02、0.90±0.04、0.72±0.05和0.65±0.01(图3)。低、中、高剂量实验组的MMP-2和MMP-9蛋白表达水平与空白对照组比较，差异均有统计学意义(均P<0.01)。

图1甘草查尔酮A(LCA)对U87细胞侵袭的影响(×100)

图2 LCA对U87细胞Bax、Bak和Bcl-2蛋白表达水平的影响

图3 LCA对U87细胞基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和MMP-9表达水平的影响

三、讨论

尽管目前脑胶质瘤治疗技术有了较大进步，但脑胶质瘤的治疗仍缺乏突破性进展，胶质瘤弥漫性浸润性生长的模式以及血脑屏障的存在增加了治疗难度，且放疗、化疗均具有无法避免的药物不良反应，整体治疗效果尚未达到理想预期，胶质母细胞瘤平均生存时间约为1年，年生存率仅为9.8%[6,7,8]。

甘草首载于东汉的《神农本草经》,是我国中医药学中常见的补气类药用植物，其药性平和通行十二经脉，有调和诸药、解毒、补虚、止咳润肺等多种功能[9]。甘草的主要成分是三萜类化合物和黄酮类化合物，LCA是甘草的主要成分之一，其抗肿瘤活性正在成为研究热点[10,11,12,13]。

胶质瘤的增殖和侵袭与肿瘤发展密切相关，加重了肿瘤恶性进展，与预后显著相关。本研究中，CCK-8和Transwell小室法实验结果表明，LCA对U87细胞的增殖和侵袭具有抑制作用，并呈现明显的浓度依赖性。Bcl-2蛋白家族中，Bcl-2原癌基因的表达产物Bcl-2通过促进线粒体通透转换孔闭合来抑制细胞凋亡，促凋亡蛋白Bax和Bak等通过激活通透转换孔开放来促进细胞凋亡，所以Bcl-2和Bax的平衡状态决定了细胞的状态的存活或者凋亡[14,15]。本研究中，随着LCA给药浓度的增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平逐渐降低，促凋亡蛋白Bax和Bak的表达水平逐渐增加，这表明LCA可降低U87细胞中Bcl-2的表达，上调Bax和Bak的表达，通过调控Bcl-2、Bax和Bak蛋白的表达平衡来促进U87细胞凋亡，抑制其增殖。

MMP主要功能是降解细胞外基质，维持细胞外基质的动态平衡，在组织重构、器官发生、炎症调控等多种生理和病理过程中发挥作用，其中MMP-2和MMP-9在胶质瘤的侵袭转移过程中发挥着重要作用，降低或阻断二者的表达可以减少胶质瘤转移的发生[16]。本研究中，随着LCA给药浓度的增加，MMP-2和MMP-9的表达水平逐渐降低，这表明LCA可通过下调MMP-2和MMP-9的表达水平抑制U87细胞的侵袭和转移能力。

LCA对U87细胞的增殖和侵袭均有抑制作用，其作用机制与调控Bcl-2、Bax和Bak的平衡，下调MMP-2和MMP-9的表达水平有关。

参考文献:

[2]王玖,罗鹏,张磊,等甘草查尔酮A对胶质瘤的增殖抑制及促凋亡作用机制研究[J]中华神经外科疾病研究杂志,2017.16(1):25

[3]方兴根,盛斌miR-577对脑胶质瘤U251细胞活力和凋亡的影响[J].郑州大学学报(医学版),2019,54(4):571-574.

[4]包翔,朱倩影,汤汇涓,等.灵芝酸D通过调控p53 /Bax通路对人结直肠肿瘤细胞的作用机制研究[J]中国临床药理学杂志,2022,

[5]陈金锐,李红,于音.菊苣酸通过磷脂酰肌醇3~激酶/蛋白激酶B信号通路抑制口腔癌KB细胞增殖､侵袭与黏附的研究[J]中国临床药理学杂志,2022,38(11):1199-1202.

[9]张燕丽,孟凡佳,田园,等炙甘草的化学成分与药理作用研究进展[J].化工工程师,2019,33(8):60-63,66.

[10]郭婉怡,袁蓓,汪倩,等甘草查尔酮A通过调控MAPK信号通路抑制MH7A细胞增殖并诱导凋亡[J]中国实验方剂学杂志,2020,

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[11]王梨明,王锐英,唐际存.甘草查尔酮A的抗肿瘤作用及机制[J].医药前沿,2019,9(34);.6-8.

[12]黄雨婷,迟宗良,王姝梅,等甘草中的黄酮类成分及其抗肿瘤活性研究进展[J]中国新药杂志,2017,26(13):1532-1537.

[13]王玖,罗鹏,费舟.甘草查尔酮A的抗肿瘤效应及分子机制[J].现代肿瘤医学, 2016,24(23)-3870-3874.