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UBE2S在食管鳞状细胞癌组织中的表达及临床意义

2024-06-20 88 上传者：管理员

摘要：目的:探讨食管鳞状细胞癌(ESCC)组织中UBE2S的表达及临床意义。方法:采用免疫组化SP法检测ESCC、上皮内瘤变中UBE2S的表达情况，分析其表达与ESCC患者临床病理特征的相关性及对预后的影响。结果:UBE2S在ESCC中的表达明显高于癌旁组织(P=0.035)。高级别上皮内瘤变(HIN)(P<0.001)及ESCC(P<0.001)的阳性率均高于瘤旁组织。HIN(P=0.016)及ESCC(P=0.008)的阳性率均高于低级别上皮内瘤变(LIN)。ESCC患者中UBE2S表达与种族有关(P<0.001),UBE2S表达与TP53(r=0.288,P<0.001)、Ki67(r=0.210,P=0.002)表达呈正相关。UBE2S表达是影响ESCC患者无进展生存期(P=0.005)和总生存期(P=0.005)的独立因素。结论:UBE2S高表达可能是ESCC患者不良预后的独立因素，而GEPIA上的UBE2S与ESCC预后无统计学意义，有待进一步研究。

关键词：
上皮内瘤变
泛素结合酶2S
预后
食管癌
食管鳞状细胞癌
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食管癌(esophageal carcinoma, EC)是中国常见的消化系统恶性肿瘤之一，据估计，2020年我国有32.4万例EC新病例，30.1万人死于食管癌[1]。食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)在我国是最常见的EC组织学类型，病死率高、侵袭性强、诊治手段有限导致患者预后不良，5年生存率约为15%～20%[2],因此发现与该疾病发生发展相关基因，研究其潜在机制，对于开发可用于治疗该疾病的特异性靶向药物具有重要意义。

泛素化是一个由泛素-蛋白酶体系统介导的连续、多步骤级联反应的蛋白修饰过程[3]。泛素化修饰异常在肿瘤的发生发展中发挥重要作用，可能为肿瘤的治疗提供新的靶点[4]。有研究表明，泛素结合酶2S(ubiquitin-conjugating enzyme 2S,UBE2S)在胶质瘤、前列腺癌和卵巢癌等肿瘤中高表达并且与预后不良有关，是促进肿瘤增殖、侵袭和转移的重要因素[5,6,7],敲除UBE2S可抑制胃癌细胞的增殖[8]。但UBE2S在ESCC发生发展的作用及发挥生物学功能的分子机制尚未完全阐明，为进一步探讨UBE2S在ESCC中的作用，本文拟采用免疫组化SP法检测UBE2S在高级别上皮内瘤变(high-grade intraepithelial neoplasia, HIN)、低级别上皮内瘤变(low-grade intraepithelial neoplasia, LIN)及ESCC中的表达，并分析UBE2S与TP53、Ki67在ESCC中的相关性及对患者预后的影响，为ESCC靶向治疗提供更充分的依据。

1、资料与方法

1.1 生物信息学

通过TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库检测EC组织中UBE2S表达情况。通过GEPIA数据库(http: //gepia.cancer-pku.cn)检测EC中UBE2S与TP53的相关性。

1.2 临床资料

收集2008年1月至2018年12月我院符合纳入标准的216例ESCC及其癌旁正常组织石蜡标本，50例高、低级别上皮内瘤变及瘤旁正常组织石蜡标本制成组织芯片。ESCC纳入标准：(1) 经病理检查证实为原发性食管鳞状细胞癌； (2)术前未接受过新辅助治疗；(3)汉族和哈萨克族患者。ESCC排除标准：(1)非鳞状细胞癌，如食管腺癌；(2)术前接受过新辅助治疗；(3)合并急危重症或者其他恶性肿瘤患者；(4)排除其他民族，如蒙古族；(5)临床资料不完整。上皮内瘤变纳入标准：(1)经病理检查证实为高、低级别上皮内瘤变；(2)完整的临床病理资料。上皮内瘤变排除标准：(1)食管鳞状细胞癌患者；(2)会诊病例。随访从手术日起至2023年4月6日止，失访在统计时作删失数据处理。本研究经我院伦理委员会批准(审批号：20180223-08),患者均知情同意。

1.3 免疫组化

采用免疫组化SP法进行检测：组织切片放入70 ℃的烤箱45 min, 软化表面覆盖的蜡层。置于二甲苯脱蜡，100%、95%、80%和70%梯度乙醇脱水；EDTA缓冲液(pH=9.0)煮沸20 min, 自然冷却。3%过氧化氢溶液封闭10 min; 山羊血清阻断，滴加一抗UBE2S(Proteintech Group, 1∶360)、 TP53(Santa Cruz biotechnology, 1∶100)和Ki67(Abcam, 1∶200), 37 ℃烤箱中孵育1 h。PBS洗涤后滴加二抗(山羊抗兔/抗鼠IgG),37 ℃烤箱中孵育30 min; DAB显色，苏木素复染30 s, 1%盐酸乙醇分化，返蓝溶液2 s, 梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂凝胶封片。

1.4 结果判定

UBE2S和TP53结果判定根据细胞染色强度及阳性细胞的百分率进行评分：UBE2S阳性定位于肿瘤细胞核和胞质，TP53阳性定位于肿瘤细胞核。(1)按肿瘤细胞阳性细胞百分比评分：≤10%为0分，11%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分，(2)按细胞染色强度评分：无阳性着色为0分，淡黄色为1分，棕色为2分，深棕色为3分；5个随机视野的两项评分乘积相加，得到总分，然后将总分除以5,得到最终评分：0分～3分为低表达，4分～12分为高表达。Ki67阳性定位于肿瘤细胞核，因染色强度无明显差异，仅对阳性细胞百分比进行评分， <50%为低表达，否则为高表达。

1.5 统计学分析

应用SPSS 25.0软件进行统计学分析。采用χ2检验或Fisher精确检验、Kaplan-Meier法和Cox比例风险回归模型。应用简单随机抽样的方法，从216例ESCC患者中抽取50例作为上皮内瘤变的对照组，Kruskal-Wallis检验瘤变、瘤旁及癌组织间的表达差异，结果经Bonferroni校正，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 数据库中UBE2S在EC的表达及验证

TCGA数据库中，食管癌中的UBE2S的表达量显著高于正常食管黏膜(P<0.001)。216例ESCC组织中UBE2S的高表达率为73.6%(159/216),而正常食管黏膜中UBE2S 的高表达率为22.7%(49/216),差异有统计学意义 (P=0.035)。

2.2 临床特征

ESCC患者年龄49岁～82岁，中位年龄64岁；肿瘤中位直径3.2 cm(0.5 cm～7.5 cm);男性155例，女性61例；汉族112例，哈萨克族104例；分化程度：中低分化160例，高分化56例；淋巴结转移：阴性147例，阳性69例；浸润深度：黏膜层5例，肌层90例，全层121例。AJCC分期：I期+II期154例，III期+IV期62例。脉管侵犯：阴性175例，阳性41例。神经侵犯：阴性172例，阳性44例。远处转移：阴性188例，阳性28例。

2.3 ESCC中UBE2S表达与临床病理特征的关系

Pearson χ2分析UBE2S表达与临床病理特征的关系 (表1):UBE2S表达与种族相关(P<0.001)。

2.4 ESCC中UBE2S与TP53、Ki67表达的相关性

Spearman相关性分析：UBE2S表达与TP53(r=0.288,P<0.001)、Ki67(r=0.210,P=0.002)表达呈正相关。GEPIA数据库相关性分析显示，UBE2S表达与TP53表达(r=0.34,P<0.001)呈正相关。

2.5 UBE2S表达对ESCC患者预后的影响

216例ESCC患者，其中1例失访，总的生存率为22.3%。Kaplan-Meier生存分析显示：ESCC的总生存期(overall survival, OS)与分化程度(P=0.007)、淋巴结转移(P<0.001)、AJCC分期(P=0.001)、神经侵犯(P=0.004)相关；ESCC患者的无进展生存期(progression-free survival, PFS)与性别(P=0.037)、肿瘤直径(P=0.035)、分化程度(P=0.006)、淋巴结转移(P<0.001)、AJCC分期(P< 0.001)、神经侵犯(P=0.009)、远处转移(P=0.037)相关。Kaplan-Meier生存分析：UBE2S表达与OS(P=0.006)和PFS(P=0.006)相关，提示UBE2S阳性患者的OS和PFS缩短。UBE2S与TP53共表达与OS(P=0.021)相关，提示UBE2S与TP53共高表达患者的OS缩短(表2)。

各单因素分析显著变量的Cox多因素比例分析：淋巴结转移 (P<0.001)、神经侵犯(P=0.001)、UBE2S表达(P=0.005)与OS相关，是影响OS的独立预后因素。淋巴结转移(P<0.001)、神经侵犯(P=0.002)、远处转移 (P=0.023)、UBE2S表达(P=0.005)是影响PFS的独立预后因素(表3)。

表1 ESCC中UBE2S表达与临床病理特征的关系n(%)

2.6 UBE2S在ESCC及上皮内瘤变的表达

UBE2S在ESCC及上皮内瘤变组织中定位在肿瘤的细胞核和细胞质(图1)。Kruskal-Wallis检验结果：UBE2S在瘤旁、HIN、LIN和ESCC的高表达占比分别为22%(11/50)、44%(22/50)、74%(37/50)和76%(38/50),总体差异具有统计学意义(P<0.001)。两两比较结果显示， HIN(P<0.001)及ESCC(P<0.001)的阳性率均高于瘤旁组织。HIN(P=0.016)及ESCC(P=0.008)的阳性率均高于LIN。

表2 ESCC患者OS和PFS的单因素分析

3、讨论

我国是食管鳞癌发病率最高的国家，占全球发病人数的57.2%[9],新疆是我国ESCC高发地区，多数患者发现已处于中晚期。虽然手术是治疗EC的主要手段，但远期效果较差，术后患者生活质量较差，5年生存率不足20%[2],尽管近几年分子靶向药物和免疫治疗在食管癌新辅助治疗中取得一定进展，但仍缺乏有效的策略，寻找新的分子治疗靶点对食管癌患者的辅助治疗具有重要意义。

UBE2S是泛素结合酶E2家族的一员，参与细胞周期调控、细胞凋亡、蛋白质泛素化调控等多种生物学功能，其在ESCC[10]、口腔鳞状细胞癌[11]、胃癌[8]和乳腺癌[12]等多种肿瘤中高表达，并在肿瘤的发生发展中发挥关键作用。本研究中，ESCC组织中UBE2S高表达率明显高于癌旁的正常黏膜(P=0.035),与生物信息学分析的结果一致。LIANG等[13]发现宫颈细胞癌中，UBE2S表达水平与AJCC分期呈正相关。YOSHIMURA等[11]发现口腔鳞癌中，UBE2S的表达与原发肿瘤的大小呈正相关。CHEN等[10]发现食管鳞癌中，UBE2S高表达与新辅助治疗的不良反应和更差的生存率有关。XIAO等[14]发现UBE2S与膀胱癌患者的淋巴结转移、AJCC分期及分化程度相关。GUO等[15]发现在低分化和病理分期较高的乳腺癌组织中，UBE2S表达上调。此外，有研究表明UBE2S高表达与胃癌患者T分期、N分期显著相关[16]。在本研究中，UBE2S高表达与种族相关(P<0.001),这可能与哈萨克族人不健康的饮食习惯和营养摄入不平衡有关[17],以上结果的差异可能与受试者的个体差异和样本量有关。在本研究结果中，UBE2S的表达与淋巴结转移、分化程度和AJCC分期无统计学意义。这并不意味着UBE2S的表达与ESCC的进展无关，这可能与本研究的样本可变性有关。

表3 ESCC患者OS和PFS的多因素分析

图1 UBE2S在食管鳞状细胞癌、上皮内瘤变及瘤旁中的表达

既往研究显示，UBE2S可促进多种肿瘤细胞的增殖[11,18,19,20,21]。本研究临床数据提示，ESCC中UBE2S的表达与Ki67表达显著正相关(r=0.210,P=0.002),而Ki67表达是评估肿瘤细胞增殖的公认标志物[22]。为进一步探讨UBE2S在ESCC中的增殖等生物学功能提供了基础。

ZHAO[8]等发现敲除UBE2S可能通过抑制作用来激活内源性FAS促进TP53的泛素化和降解，从而促进胃癌细胞的凋亡。ZHANG[23]等发现肝细胞肝癌中，TP53突变的患者UBE2S基因表达较高，提示UBE2S表达与TP53的功能有关。PAN[24]等发现UBE2S通过增强TP53的泛素化促进其在肝细胞癌中的降解而表现出致癌活性，促进癌细胞增殖转移。LIU[25]等发现UBE2S可以调控TP53信号通路，促进肺腺癌的进展。本研究中，UBE2S表达与TP53表达呈显著正相关(r=0.288,P<0.001),UBE2S与TP53共高表达患者的OS明显缩短(P=0.021),基于以上结果，我们怀疑，UBE2S可能是通过影响TP53基因的突变促进肿瘤进展，为进一步探讨ESCC中UBE2S与TP53突变的相关性及相关机制提供了基础。

各单因素分析显著变量的Cox多因素比例分析显示UBE2S表达是影响PFS(P=0.005)和OS(P=0.005)的独立预后因素。UBE2S高表达ESCC患者生存期短、预后较差，提示UBE2S对ESCC预后具有较好的诊断价值，而GEPIA上的UBE2S与ESCC预后无统计学意义，结果的差异可能与受试者的个体差异和样本量有关，需进一步研究。

值得注意的是，UBE2S在瘤旁的表达率显著低于HIN(P<0.001)及ESCC(P<0.001)中的表达，而LIN中UBE2S阳性率显著低于HIN(P=0.016)及ESCC(P=0.008),UBE2S可能是ESCC进展的重要标志物，有望成为食管肿瘤诊断指标之一。

本研究还存在一定局限性，首先，UBE2S、Ki67和TP53的判读标准是暂定的，无标准化；其次，本组仅采用免疫组化分析UBE2S在ESCC和上皮内瘤变的表达，未进行基因扩增分析；最后，免疫组化检测的TP53基因主要为突变型，由于不能准确区分突变型和野生型，其精确性尚难保证，故检验方法尚需改进。

综上所述，ESCC中，UBE2S可能与肿瘤的进展有关，UBE2S是否作为ESCC患者潜在的预后生物学标志物有待进一步研究。本文首次分析ESCC和上皮内瘤变中UBE2S的表达差异，以及ESCC中UBE2S表达与TP53和Ki67的相关性，为进一步研究UBE2S与ESCC增殖、侵袭转移等恶性特征相关性、潜在分子机制及新诊疗靶点提供了依据。

参考文献:

[4]郑智,尹杰,张军,等.泛素特异性蛋白酶在肿瘤演进过程中的研究进展[J].国际外科学杂志,2021,48(11):774-777.

[16]赵天豪,杨一群,李岳彤,等.泛素结合酶2S在胃癌中的表达及临床意义[J].中华全科医学,2023,21(04):555-559.

基金资助:省部共建中亚高发病成因与防治国家重点实验室开放课题基金(编号:SKL-HIDCA-2020-4); 国家自然科学基金(编号:81860422); 新疆维吾尔自治区自然科学基金(编号:2022D01D71);

文章来源:李湾,李梦妍,刘贤文,等.UBE2S在食管鳞状细胞癌组织中的表达及临床意义[J].现代肿瘤医学,2024,32(14):2561-2565.