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不同种源黄花蒿室内水培条件下青蒿素和青蒿乙素含量差异分析

2021-09-28 68 上传者：管理员

摘要：目的:建立不同种源黄花蒿内青蒿素及青蒿乙素含量测定的方法,比较不同来源黄花蒿种质在水培均一化生长条件下青蒿素与青蒿乙素含量的差异,分析影响黄花蒿主要成分含量差异的关键因素。方法:黄花蒿种子采用随机排列水培混合培养,运用超高效液相色谱-串联质谱法,ACQUITYUPLC?BEHC18色谱柱（2.1mm×100mm,1.7μm）,流动相选择水-乙腈（95∶5,含0.1%甲酸,A）-乙腈-水（95∶5,含0.1%甲酸,B）进行梯度洗脱（0～3.5min,25%～1%A;3.5～3.6min,1%～25%A;3.6～5.0min,25%A）,流速0.4mL•min-1,电喷雾离子源,正离子模式,检测不同种源黄花蒿中青蒿素及青蒿乙素的含量差异。结果:所建立的方法灵敏度高、分离度良好。不同种源黄花蒿在相同培养条件下,即25℃恒温下循环水培养,青蒿素和青蒿乙素含量存在较大差异,其中青蒿素含量较高的黄花蒿种源产地是云南,质量分数达3810.597μg•g-1;青蒿乙素含量较高的黄花蒿种源地是山西,质量分数1691.747μg•g-1,青蒿素含量按照从高到低种源地排列依次为云南>海南>湖北>广西>浙江>山西>北京>山东>黑龙江>甘肃。相关性分析发现,以地域划分时,青蒿素含量与黄花蒿来源地的纬度呈显著负相关,但青蒿素与青蒿乙素含量均与经度无显著相关性。结论:同一培养环境不同种源黄花蒿内青蒿素及青蒿乙素含量存在显著差异,影响黄花蒿中青蒿素及青蒿乙素含量的主导因素可能是其遗传背景,提示改良青蒿品种是后续黄花蒿栽培中提升质量的关键因素。

关键词：
水培
种质
经纬度
超高效液相色谱-串联质谱法
青蒿乙素
青蒿素
黄花蒿
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青蒿为菊科植物黄花蒿Artemisiaannua的干燥地上部分[1]，距今已有2000多年的应用历史。葛洪的《肘后备急方》首次记载了黄花蒿具有治疗疟疾的作用[2]，还可治疗由疟疾引起的间歇性发烧、骨蒸和疲惫[3]，具有缓解中暑、止血、镇痛等活性[4]。随着对青蒿研究的深入，发现其除了可治疗疟疾外，还可治疗肺结核[5]、疥疮、急性惊厥等，具有抗病毒、抗真菌、抗炎、抗癌等作用[5,6,7,8]。黄花蒿的主要有效成分青蒿素是目前抗疟特效药[9]。疟疾是一类由疟原虫引起的严重危害人类健康及生命安全的寄生虫病，根据世界卫生组织发布的《2020年世界疟疾报告》[10]，全球感染疟疾的人数在2.3亿左右，死亡人数约为40万人，与之前相比，感染疾病人数及死亡人数虽略有下降，但疟疾仍是威胁人类健康的一类传染性疾病[11]。近几年，全球青蒿素用量近180吨（1吨=1000kg），但由于野生黄花蒿中青蒿素含量低且质量不稳定，致使大部分原料不具备商业价值，故出现青蒿素需求缺口大[12]而青蒿素原料供不应求的现状。

在我国，黄花蒿天然群体呈现一定地域性[14]，高品质青蒿最适宜产区主要分布于秦岭淮河以南地区。不同基原黄花蒿因采收时间、气候环境、肥料等因素的不同，会对黄花蒿次生代谢物的积累产生影响，导致难以评价黄花蒿类群的品质[15,16]。由于目前还无法实现青蒿素的体外生物全合成，因此，青蒿素的获取仍依赖于植物提取。但黄花蒿主要依靠人工栽培，质量良莠不齐，因此，培育优良药用植物新品种是保障优质药材生产的前提[17]，明确影响黄花蒿品质的主导因子是研究关键。

选择合理的评价指标对黄花蒿质量标准的评定至关重要。黄花蒿内发挥作用的成分为倍半萜类成分——青蒿素类化合物[18]，青蒿素的合成属于类异戊二烯的合成途径，起源于异戊烯基焦磷酸及二甲基丙烯基焦磷酸[19,20]，已有文献报道青蒿乙素可能是合成青蒿素的前体物质[21]，说明青蒿乙素对于青蒿素的合成意义重大。因此，本研究拟对青蒿素及青蒿乙素2个成分进行定量分析。目前关于此二者含量测定的方法较多，主要有薄层色谱法（TLC），紫外分光光度法（UV）和高效液相色谱法（HPLC）等[22]。本研究选择超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）进行检测[23]，一方面，TLC和UV等方法的灵敏度较低且易受干扰；另一方面，青蒿素类化合物因其特殊的过氧桥结构而对紫外吸收不明显，需要经过衍生化处理，再进行HPLC分析，方法较为繁琐[23]；而液质联用技术将色谱对复杂样品的高分离能力及质谱的高选择性、高灵敏度等特性结合起来，比较适合用于这类无紫外吸收的化合物的定量分析。

古籍中对道地药材的形成与生态环境之间的关系已有初步认识和记载，认为药材品质与生态环境密切相关[24]，例如，《本草经集注》记载“诸药所生，皆有境界”。有学者收集全国各地黄花蒿中的青蒿素含量数据，分析了该成分含量与气候因子及地理分布之间的关系，结果表明青蒿素含量与日照、气温、降水量及产地纬度密切相关[25]。根据物种多样性与气候数据库，研究人员认为黄花蒿适宜产区分布在北美洲东部、欧洲西部及亚洲东部[26]；在亚热带地区，其青蒿素质量分数在0.4%～0.7%[27,28]，在温带和寒带地区则<0.1%[29,30]。然而，以上研究均未区分黄花蒿生长过程中的遗传因素、环境因素和人为因素，基于此，本研究拟采用随机分布水培方式，对不同种源黄花蒿叶片中的青蒿素及青蒿乙素含量进行测定，比较在相同环境下不同种源黄花蒿中这2种成分的差异，探讨同一环境及栽培模式下不同产地黄花蒿内青蒿素及青蒿乙素含量与其经纬度之间的相关性，以期为黄花蒿的育种提供数据支持。

1、材料

ACQUITYI-Class型高效液相色谱仪与XevoTQ-Smicro型三重四级杆串联质谱仪（美国Waters公司），XS105型1/10万电子分析天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]，JXFSTPRP-GN型多样品组织研磨仪（上海净信实业发展有限公司），BS210S型1/1万电子分析天平（德国赛多利斯公司），MilliQ型超纯水机（美国Millipore公司）。青蒿素对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号CF201801，纯度≥98%），青蒿乙素对照品（上海瀚香生物科技有限公司，批号HX201810226，纯度≥98%），水为超纯水，甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

云南、山西、海南等10个地区的黄花蒿种子均由中国中医科学院中药研究所向丽副研究员采集，运用水培方法将种子萌发为完整的植株，植株经中国中医科学院中药研究所向丽副研究员鉴定为菊科植物黄花蒿A.annua，种子经DNA条形码技术再次验证鉴定。每个产地6个生物学重复，每个生物学重复进行3个技术重复，具体采集样本信息见表1。

首先筛选出干净的种子（部分种子带壳），不同地域的黄花蒿种子随机种于海绵盘，倒入适量水，使海绵充分吸水，待其发芽后放置于黑暗处，盖上保鲜膜，25℃恒温培养，长出根为止（根透过海绵）将其随机种到水培间循环水培养数周，生长一段时间后采集叶片；水培样品顺序见图1。

2、方法与结果

2.1色谱条件

使用WatersACQUITYUPLC®BEHC18色谱柱（2.1mm×100mm,1.7μm），流动相水-乙腈（95∶5，含0.1%甲酸，A）-乙腈-水（95∶5，含0.1%甲酸，B）梯度洗脱（0～3.5min,25%～1%A;3.5～3.6min,1%～25%A;3.6～5.0min,25%A），流速设定0.4mL·min-1，柱温35℃，进样量1μL。

2.2质谱条件

电喷雾离子源（ESI），离子源温度500℃，锥孔气及脱溶剂气均为氮气，脱溶剂气流速800L·h-1，锥孔气流速50L·h-1，毛细管电压3kV，数据采集模式为多反应监测（MRM）模式，在正离子模式下采集，运用外标法计算每个化合物的含量；数据分析使用仪器自带MassLynx4.2SCN977及TargetLynx进行分析，数据统计运用R语言。

2.3溶液的制备

2.3.1对照品溶液

取青蒿素对照品5.0mg，精密称定后加入乙腈1mL，配成5g·L-1青蒿素对照品溶液；取青蒿乙素对照品5.0mg，精密称定后加入乙腈1mL，配成5g·L-1青蒿乙素对照品溶液；分别取青蒿素及青蒿乙素对照品溶液适量，加入50%乙腈（含0.1%甲酸）稀释成青蒿素、青蒿乙素质量浓度均为1g·L-1的混合对照品溶液。

2.3.2供试品溶液

收集叶片后进行冷冻干燥，运用组织研磨仪将样品研成极细粉（功率50Hz，研磨时间40s）。称取0.01g于1.5mL的离心管中，加入80%甲醇（含0.1%甲酸）1mL，超声30min(100W,40kHz），以12000×g,4℃离心20min，吸取上清液至新的1.5mL离心管中备用，置于-80℃冰箱保存；进样前取出样品平衡至室温，再用50%乙腈稀释10倍，待测。

2.4方法学考察

2.4.1专属性试验

取2.3项下制备的溶液，按2.1和2.2项下条件测定，见图2。结果显示，各成分之间无干扰，该方法专属性良好。

2.4.2线性关系考察

分别精密吸取混合对照品溶液适量，加50%乙腈（含0.1%甲酸）稀释，配成系列质量浓度的混合对照品溶液，按2.1和2.2项下条件测定。以对照品质量浓度（mg·L-1）为横坐标轴，峰面积为纵坐标轴，绘制标准曲线，得青蒿素、青蒿乙素回归方程分别为Y=1.26859X+17.8085(R2=0.9994),Y=4.172X+56.3324(R2=0.9996），线性范围均为0.0625～2mg·L-1。

2.4.3精密度试验

取同一供试品溶液，按2.1和2.2项下条件连续进样6次，计算青蒿素及青蒿乙素峰面积的RSD分别为2.4%和2.5%，表明仪器精密度良好。

2.4.4重复性试验

分别精密称取同一份黄花蒿样品6份，按2.3.2项下方法制备供试品溶液，按2.1和2.2项下条件测定，计算青蒿素和青蒿乙素平均质量分数为5988.736,1041.428μg·g-1,RSD分别为1.1%,5.1%，表明该方法重复性良好。

2.4.5稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于制备后0,1,2,4,8,12,24h按2.1和2.2项下条件测定，计算青蒿素和青蒿乙素峰面积的RSD分别为4.0%,2.3%，表明供试品溶液在24h内稳定性较好。

2.4.6加样回收率试验

精密称取已知指标成分含量的样品粉末0.005g，共6份，分别加入青蒿素及青蒿乙素（质量浓度分别为0.982,0.049mg·L-1）的混合对照品溶液1mL，按2.3.2项下方法制备供试品溶液，按2.1和2.2项下条件测定，计算青蒿素平均加样回收率103.82%,RSD6.1%；青蒿乙素平均加样回收率102.51%,RSD6.0%，表明该方法准确性良好。

2.5样品测定

不同种源黄花蒿中青蒿素与青蒿乙素的质量分数见表1。结果发现不同种源黄花蒿水培后这2个成分的含量均存在较大差异，其中，青蒿素含量较高的种源地是云南，平均质量分数达到3810.597μg·g-1，其次是海南，平均值3702.952μg·g-1；青蒿乙素含量最高的是山西，平均质量分数达到了1691.747μg·g-1，其次是山东，平均值1380.204μg·g-1；甘肃采集黄花蒿种子经水培后青蒿素及青蒿乙素的含量均较低，质量分数分别为17.181,10.813μg·g-1，分别为云南青蒿素及青蒿乙素含量的0.5%及2.8%，以及山西的1.6%及0.6%。由图3可知，湖北产地的黄花蒿与其他产地相比，其青蒿素含量波动较大，根据统计结果得标准差1758.445μg·g-1，这在研究中应当引起关注；源于北京的黄花蒿中青蒿素含量波动值较小，标准差269.584μg·g-1；青蒿乙素在山西及山东产地黄花蒿中的含量相对波动较大，标准差分别为338.004,374.68μg·g-1。根据以上实验数据可以看出，不同产地黄花蒿中青蒿素、青蒿乙素含量具有很大差异，以青蒿乙素质量分数为纵坐标，青蒿素质量分数为横坐标，进行聚类分析，见图4，以青蒿乙素质量分数/青蒿素质量分数=0.5作为分界线（图中灰色虚线）。结果显示，10个产地的黄花蒿被自然分为2个类群，位于灰色虚线左边的产地有山西、北京、黑龙江、山东、浙江、甘肃，位于灰色虚线右边的产地为云南、海南、湖北、广西，这4个产地均位于秦岭淮河以南地区；聚类分析结果与其他学者发现的野生黄花蒿含量变化规律一致，具有明显的空间聚集特征[25]。

2.6相关性分析

黄花蒿中青蒿素、青蒿乙素含量与种源地的相关性分析见图5,6。结果发现青蒿素含量与种源地经度呈负相关（r=0.431），但相关性不显著；青蒿素含量与种源地纬度显著相关（r=0.851,P<0.01），表明青蒿素含量与纬度变化密切相关。青蒿乙素含量与种源地经度、纬度均呈正相关（r分别为0.516,0.555），但这种相关性均不显著。综上所述，不同种源的黄花蒿在同一培养环境下培养青蒿素与青蒿乙素的含量差异具有统计学意义，青蒿素与青蒿乙素含量与种源地纬度的关系相对于经度来说更加紧密一些，说明在培养环境一致的情况下，不同种源的黄花蒿中青蒿素及青蒿乙素的含量依然是有差别的。

3、讨论

为了比较不同种源黄花蒿中青蒿素及青蒿乙素的含量，本研究将云南、北京、黑龙江、山东、山西，湖北等不同来源的黄花蒿种子置于同一环境下水培，然后建立基于UPLC-MS/MS快速测定其中2种化合物含量的方法，通过方法学考察，证明该方法专属性良好；根据含量测定结果，不同种源黄花蒿在同一培养环境下的青蒿素及青蒿乙素含量的差异具有统计学意义（P<0.01），以青蒿素含量为参考，种源地为云南及海南的黄花蒿质量较好，而来源于甘肃的质量较差；依据青蒿素质量分数与青蒿乙素质量分数的比值，运用笛卡尔坐标系将10个种源的黄花蒿分为2个类群，其中位于秦岭淮河以南的地区即青蒿素含量较高的地区聚为一类；为了进一步比较相关差异，对2种化合物的含量与不同种源地的经纬度作相关性分析，结果表明不同种源黄花蒿中青蒿素含量与纬度显著相关，与不同环境下所得研究结果一致[25]，具有明显空间聚集，但本文研究结果中青蒿乙素含量与种源地的经纬度未呈现显著相关性。

高品质药材的形成与环境饰变、遗传背景及人为因素密切相关。本研究考察了在同一培养环境下黄花蒿中青蒿素与青蒿乙素的含量差异，并进行相关性分析，结果表明在同一环境下生长的黄花蒿中青蒿素变化规律与不同环境下黄花蒿中青蒿素变化规律一致，推测其种质遗传背景对青蒿素及青蒿乙素的含量具有更为关键的影响，进一步解析不同种源遗传背景及相互之间的差异，可对后续黄花蒿的优良品种筛选提供依据。本研究将不同种源的黄花蒿置于同一环境下培养，探究了青蒿素、青蒿乙素含量与种源的关系，但高品质黄花蒿形成机制的阐释不太全面，仍需在环境饰变、遗传背景及人为因素方面进行深入研究。

参考文献：

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部[M].北京:中国医药科技出版社，2020:207.

[2]向丽，张卫，陈士林.中药青蒿本草考证及DNA鉴定[J].药学学报，2016,51(3).486-495.

[3]韦记青，韦霄，蒋水元，等.广西黄花蒿资源及发展策略[J].广西农学报，2005,20(3):24-26.

文章来源：程睿旸,贺文瑞,沈晓凤,向丽,梁毓,孟莹,刘倩文,凡贞洁,孙伟,徐江,陈士林.不同种源黄花蒿室内水培条件下青蒿素和青蒿乙素含量差异分析[J].中国实验方剂学杂志,2021,27(20):145-151