神经性疼痛（NP）是一种慢性疼痛，全球发病率约5%，已成为一个重要的公共卫生问题[1]。脊髓胶质细胞、免疫炎症等参与了NP的发展，激活的脊髓小胶质细胞通过释放促炎细胞因子和其他促进疼痛传递的介质，对NP病情发展起重要作用[2]。目前，现有治疗NP的药物存在疗效有限、不良反应多等问题[3]。木犀草素是一种天然类黄酮，主要存在于金银花、菊花等中药中，具有多种药理学活性，如镇痛、抗炎、神经保护等[4]。Zhou等[5]研究发现，木犀草素可抑制小鼠脊背角的Nod样受体蛋白3(NLRP3）炎症小体和神经胶质激活，从而缓解因肺癌引起的骨痛。华汤锋等[6]对慢性坐骨神经结扎大鼠研究发现，木犀草素通过减轻炎症反应、降低疼痛相关基因表达，可显著改善大鼠的痛觉敏化。但木犀草素缓解疼痛及其他作用的机制有待阐明。单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1）及其受体CC趋化因子受体2(CCR2）在免疫调节和单核细胞炎症的启动中发挥重要作用，研究表明，该通路蛋白在中枢性中风后疼痛大鼠脊髓中表达上调[7]。MCP-1/CCR2通路激活，可刺激小胶质细胞活化，在促进慢性疼痛方面起重要作用[8]。木犀草素通过MCP-1/CCR2信号轴对NP大鼠的神经胶质激活和免疫应答影响机制尚不清楚。本研究采用坐骨神经慢性压迫损伤法构建大鼠NP模型，并对此进行探讨。

1、材料与方法

1.1实验动物

体质量180～220 g的雄性SD大鼠（武汉大学动物实验中心）72只，生产许可证编号：SCXK（鄂）20190004；使用许可证编号：SYXK（豫）20200013。动物分笼饲养，饲养环境25～26℃，明暗循环12 h，自由饮食、饮水。本研究经南阳医学高等专科学校伦理委员会批准（审批号：202310257）。

1.2试剂与仪器

木犀草素（批号XY-BZP-2253），上海烜雅生物科技有限公司；阳性药物阿魏酸钠（国药准字H20053893），重庆华森制药股份有限公司；白细胞介素-6(IL-6）、白细胞介素-1β(IL-1β）、肿瘤坏死因子-α(TNF-α）酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒（批号分别为CSB-E04640r-1、CSB-E08055r-1、CSB-E11987r-1），上海恒斐生物科技有限公司；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（批号L9406-1），北京蓝博斯特生物技术有限公司；兔源一抗离子钙接头蛋白分子1(Iba-1）（批号ab283319）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）（批号：ab4674）、MCP-1（批号ab7202）、CCR2（批号ab313463）、抗原递呈细胞标记的CD3(APC-CD3）（批号ab25041）、藻红蛋白标记的CD8(PE-CD8）（批号ab313760）、异硫氰酸荧光素标记的CD4(FITC-CD4）（批号ab59474）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）（批号ab9485）抗体、二抗（辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白G）（批号ab205718），英国abcam公司。

机械测痛仪（型号Von Frey），上海塔正科技有限公司；热痛觉测试仪（型号35100），香港友诚生物科技有限公司；流式细胞仪（型号Moni Sight），森西赛智科技有限公司；实时荧光定量聚合酶链反应仪（型号MA-1630Q），寰熙医疗科技有限公司；荧光显微镜（型号MHIF2000），广州市明慧科技有限公司；离心机（型号Allegra X-30），上海贝克曼库尔特国际贸易有限公司；多功能酶标仪（型号CLARIOstar），北京科月华诚科技有限公司。

1.3动物建模、分组和干预

采用坐骨神经慢性压迫损伤法构建大鼠NP模型[9]。大鼠经戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，右后肢大腿去毛，手术分离右股骨下缘肌肉，暴露坐骨神经后，羊肠线打4个结，间隔1 mm，不阻断神经血供。大鼠出现舔舐、跛行及悬空等行为视为造模成功。将造模成功大鼠分为模型组、阿魏酸钠组及木犀草素低、中、高剂量组，每组12只。另选择同龄12只大鼠作为假手术组。假手术组大鼠仅游离坐骨神经但不结扎。参照前期研究文献[6]，木犀草素低、中、高剂量组腹腔注射25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg的木犀草素加灌胃等剂量生理盐水。阿魏酸钠组大鼠灌胃阿魏酸钠（150 mg/kg）加腹腔注射等剂量生理盐水[10]；假手术组、模型组腹腔注射加灌胃等剂量生理盐水。每日1次，持续14 d。

1.4指标检测

1.4.1大鼠疼痛敏化行为学分析

检测造模前1天和造模后第1、3、7、14天大鼠机械性缩足反射阈值（MWT）和热刺激缩足反射潜伏期（TWL）。MWT：利用von Frey Hair纤维丝刺激大鼠足底部，记录大鼠后肢回缩时间，重复6次，每次间隔2 min。TWL：利用辐射热痛觉测试仪照射大鼠足底部，记录开始照射到出现缩足的时间，重复6次，每次间隔5 min。

1.4.2实时荧光定量聚合酶链反应（q RT-PCR）检测Iba-1、胶质纤维酸性蛋白（GFAP)m RNA表达

大鼠疼痛敏化行为学分析结束后，麻醉处死大鼠并收集外周血，然后取第4腰椎至第6腰椎（L4—L6）脊髓段，随机取每组6只大鼠脊髓段固定在多聚甲醛中用于免疫组织化学检测和HE染色实验，剩余6只大鼠脊髓组织保存在-80℃冰箱中，进行后续q RT-PCR、ELISA及蛋白质印迹法（Western blotting）实验。

根据总RNA制备试剂盒的说明，从每组大鼠脊髓中提取总RNA，反转录试剂盒逆转录成c DNA。Primer Premier 6.0软件设计定量聚合酶链反应（PCR）引物。按照使用试剂盒说明进行q RT-PCR扩增。程序：预变性（95℃，2 min），变性（95℃，30 s），退火（60℃，30 s），延伸（72℃，20 s),42个循环。Iba-1正向引物5’-GCAGCCTCATCGTCATCT-3’和反向引物5’-CTCTCTTCCTGTTGGGCTT-3’;GFAP正向引物5’-GAGTGGTATCGGTCCAAGTT-3ʹ’和反向引物5’-CTCAAGGTCGCAGGTCAA-3’；内参正向引物5’-ACTAGGCGCTCACTGTTCT-3’和反向引物5’-CCAATACGACCAAATCCGT-3’。以2-ΔΔCt法计算Iba-1、GFAP m RNA的相对表达量。

1.4.3免疫组织化学检测Iba-1、GFAP蛋白表达

多聚甲醛固定各组大鼠脊髓组织，乙醇梯度脱水、石蜡包埋后制备切片（4µm），用3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶活性。随后，在柠檬酸盐缓冲液中煮沸30 min以提取抗原。滴加山羊血清，37℃封闭35 min。并将Iba-1、GFAP(1∶200）一抗在4℃下与磷酸盐缓冲液作为对照孵育过夜。磷酸盐缓冲液洗涤3次，切片与荧光标记的二抗（1∶500）在37℃孵育60 min。切片在磷酸盐缓冲液中洗涤后分别用3,3-四盐酸二氨基联苯胺和苏木精复染。封片后荧光显微镜观察。Image Pro Plus 6.0软件计数分析Iba-1、GFAP相对荧光强度。

1.4.4 T淋巴细胞亚群检测

将1.4.2中收集的外周血，加入APC-CD3、PE-CD4、FITC-CD8抗体于室温下避光孵育30 min，再加入1 m L溶血剂，室温孵育15 min,1 000 r/min离心5 min后（离心半径8 cm），倒掉上清。磷酸盐缓冲液重悬后，用流式细胞仪检测CD4+、CD8+T细胞水平，并计算其比值。

1.4.5 HE染色观察大鼠脊髓病理学改变

脊髓组织经过固定、石蜡处理，然后脱蜡，水化后切片（4µm）。将组织切片用苏木精溶液处理2 min并冲洗。之后加入伊红溶液孵育2 min。随后，将切片干燥并拍摄照片。随机选择5个视野观察分析脊髓组织的病理变化。

1.4.6 ELISA法检测脊髓中炎症因子水平

脊髓经充分研磨后，4 000 r/min离心16 min，离心半径8 cm，收集上清。根据ELISA试剂盒说明书检测大鼠脊髓上清中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平。

1.4.7 Western blotting检测MCP-1、CCR2蛋白表达

根据蛋白提取试剂盒的说明提取脊髓总蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法定量蛋白浓度。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，然后转移到聚偏氟乙烯膜上，在缓冲液中用5%脱脂牛奶封闭2 h。加入MCP-1、CCR2一抗，将膜与MCP-1、CCR2一抗用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐-山梨醇酐单月桂酸酯聚氧乙烯（20）醚缓冲溶液（TBST）洗涤，洗涤后，将聚偏氟乙烯膜与二抗[辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔免疫球蛋白G]一起孵育，加入显影液，用Image J软件分析蛋白相对表达。GAPDH作为内参。

1.5统计与分析

实验数据用Graphpad Prism 9.0软件进行分析，计量资料以表示，多组间的比较用单因素方差分析，SNK-q检验用于两组间的比较。取α=0.05为检验水准。

2、结果

2.1各组大鼠MWT比较

与假手术组比较，模型组MWT降低（P<0.05）。与模型组比较，木犀草素低、中、高剂量组及阿魏酸钠组MWT升高，且木犀草素作用效果呈剂量依赖性（P<0.05）。木犀草素高剂量组与阿魏酸钠组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2各组大鼠TWL比较

与假手术组比较，模型组TWL降低（P<0.05）。与模型组比较，木犀草素低、中、高剂量组及阿魏酸钠组TWL升高，且木犀草素作用效果呈剂量依赖性（P<0.05）。木犀草素高剂量组与阿魏酸钠组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.3各组大鼠脊髓中Iba-1、GFAP m RNA及蛋白表达比较

与假手术组比较，模型组Iba-1、GFAP m RNA及蛋白表达升高（P<0.05）。与模型组比较，木犀草素低、中、高剂量组及阿魏酸钠组Iba-1、GFAP m RNA及蛋白表达降低，且木犀草素作用效果呈剂量依赖性（P<0.05）。木犀草素高剂量组与阿魏酸钠组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见图1和表3。

2.4各组大鼠外周血中CD4+、CD8+T细胞水平比较

与假手术组比较，模型组CD4+T细胞比例及CD4+/CD8+比值均降低，CD8+T细胞比例升高（P<0.05）。与模型组比较，木犀草素低、中、高剂量组及阿魏酸钠组CD4+T细胞比例及CD4+/CD8+比值均升高，CD8+T细胞比例降低，且木犀草素作用效果呈剂量依赖性（P<0.05）。木犀草素高剂量组与阿魏酸钠组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见图2和表4。

表1 各组神经性疼痛模型大鼠机械性缩足反射阈值比较

2.5各组大鼠脊髓病理学改变

假手术组大鼠脊髓无明显病理损伤。与假手术组比较，模型组大鼠细胞排列紊乱，细胞变形，有明显空泡化。与模型组比较，木犀草素低、中、高剂量组及阿魏酸钠组大鼠脊髓组织损伤明显减轻，木犀草素高剂量组与阿魏酸钠组大鼠脊髓病理学改变基本一致。见图3。

表2 各组神经性疼痛模型大鼠热刺激缩足反射潜伏期比较

图1 各组神经性疼痛模型大鼠脊髓中离子钙接头蛋白分子1、胶质纤维酸性蛋白表达（×100，标尺为100μm，免疫组织化学法）

表3 各组神经性疼痛模型大鼠脊髓中Iba-1、GFAP m RNA及蛋白表达比较

图2 各组神经性疼痛模型大鼠外周血中CD4+、CD8+T细胞水平

表4 各组神经性疼痛模型大鼠外周血中CD4+、CD8+T细胞水平比较

2.6各组大鼠脊髓中炎症因子水平比较

与假手术组比较，模型组炎症因子水平升高（P<0.05）。与模型组比较，木犀草素低、中、高剂量组及阿魏酸钠组炎症因子水平降低，且木犀草素作用效果呈剂量依赖性（P<0.05）。木犀草素高剂量组与阿魏酸钠组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表5。

2.7各组大鼠脊髓中MCP-1、CCR2蛋白表达比较

与假手术组比较，模型组MCP-1、CCR2蛋白表达升高（P<0.05）。与模型组比较，木犀草素低、中、高剂量组及阿魏酸钠组MCP-1、CCR2蛋白表达降低，且木犀草素作用效果呈剂量依赖性（P<0.05）。木犀草素高剂量组与阿魏酸钠组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见图4和表6。

3、讨论

NP是病理性疼痛的主要类型，是一种由周围神经系统和中枢神经系统躯体感觉功能受损引起的慢性疾病，患者表现为感觉迟钝、痛觉过敏和异常性疼痛[11]，是造成残疾的主要原因之一[12]。因此，深入探索NP的发病机制，对研发治疗NP的新药物具有重大意义。

越来越多的证据表明，神经炎症和免疫系统在NP的进展中起重要作用。神经胶质细胞（包括星形胶质细胞和小胶质细胞）是疼痛的强大调节剂。在疼痛的刺激下，胶质细胞被激活，星形胶质细胞活化标志物GFAP和小胶质细胞标志物Iba-1表达升高，小胶质细胞是中枢神经系统的重要免疫成分，响应刺激可促进炎症介质如IL-6、TNF-α和IL-1β的释放，与感觉神经元表面受体结合，增强神经元兴奋性，从而引起持续的疼痛超敏反应[13-14]。在周围NP模型中，星形胶质细胞被激活后，释放大量因子（如一氧化氮、前列腺素、兴奋性氨基酸），参与疼痛维持[15]。因此，调节胶质细胞有助于NP的治疗。本研究使用阿魏酸钠作为阳性对照组，阿魏酸钠常用于临床偏头痛、血管性头痛等的治疗，且也有研究显示阿魏酸钠能抑制大鼠神经病理性疼痛[16]。本研究发现，Iba-1、GFAP m RNA及蛋白在NP大鼠中高表达，NP可激活星形胶质细胞和小胶质细胞。经木犀草素及阿魏酸钠干预后，NP大鼠脊髓中Iba-1、GFAP m RNA及蛋白表达、炎症因子水平（IL-6、IL-1β、TNF-α）显著降低，MWT、TWL升高，NP大鼠机械痛敏和热痛敏得到缓解。提示木犀草素缓解NP的作用可能是通过降低炎症因子水平、抑制小胶质细胞活化实现的。

图3 各组神经性疼痛模型大鼠脊髓病理损伤比较（×200，标尺为100μm)

表5 各组神经性疼痛模型大鼠脊髓中炎症因子水平比较

图4 各组大鼠脊髓中单核细胞趋化蛋白-1、CC趋化因子受体2蛋白表达比较

表6 各组大鼠脊髓中MCP-1、CCR2蛋白表达比较

NP的发展与免疫功能紊乱密切相关，T淋巴细胞亚群（CD3+、CD4+和CD8+）是机体免疫系统中的重要组成部分。CD4+和CD8+细胞通过释放IL-6、IL-1β、TNF-α等细胞因子和其他炎症介质在辅助和调节免疫方面发挥重要作用，其比例失衡可加快NP发展进程[15]。有研究发现，CD4+T细胞可以抑制由周围神经结扎和炎症性疼痛引起的NP[17]。本研究发现，木犀草素可提高NP大鼠外周血中CD4+T细胞比例及CD4+/CD8+比值，降低CD8+T细胞比例。提示木犀草素具有缓解NP的作用，其机制可能与抗炎、增强免疫有关。

MCP-1及CCR2是一种小分泌蛋白，作为重要的促炎介质，能将免疫细胞（巨噬细胞、单核细胞、T淋巴细胞等）募集到受损组织，并在NP的炎症反应中起关键作用[18]。MCP-1 m RNA及蛋白在多种NP模型中表达上调[19]。背根神经节中的MCP-1/CCR2信号激活可促进外周炎症性疼痛致敏[20]。CCR2激活通过瞬时受体电位通道的反式激活使伤害感受器敏感。研究表明，MCP-1通过介导丘脑出血性中风后脊髓神经元和神经胶质细胞的激活引起中枢性中风后疼痛，抑制MCP-1/CCR2信号通路的激活可抑制Iba-1和GFAP的表达[7]。鞘内注射MCP-1，可产生快速热痛觉过敏和机械性异常性疼痛[21]。鞘内施用MCP-1中和抗体或CCR2拮抗剂可通过减少局部炎症，缓解不同NP模型中的机械性异常性疼痛[20,22]。本研究表明，MCP-1、CCR2蛋白在NP大鼠脊髓中高表达，与其他研究结果一致[19]。木犀草素可显著降低NP大鼠脊髓中MCP-1、CCR2蛋白表达，提示木犀草素具有抗炎、增强免疫、抑制胶质细胞活化、缓解NP的作用，其作用机制可能与抑制MCP-1/CCR2信号轴的激活有关。

参考文献:

[6]华汤锋,金红芳,吕晨,等.腹腔注射木犀草素调控sirt1/FOXO1通路对慢性坐骨神经结扎大鼠痛觉敏化的影响[J].浙江医学,2021,43(14):1489-1493,1512.

[9]伍兰,田彬,向红,等.依托咪酯对慢性神经病理性疼痛大鼠脊髓小胶质细胞活化的影响及其作用机制[J].广西医科大学学报,2023,40(3):440-446.

[10]王士珍,张晓蕾,丁苏彭,等.小檗碱对神经病理性疼痛大鼠疼痛行为及IRAK1/TRAF6信号通路介导的神经炎症的影响[J].中国病理生理杂志,2022,38(9):1561-1568.

[16]王士珍,张晓蕾,丁苏彭,等.小檗碱对神经病理性疼痛大鼠疼痛行为及IRAK1/TRAF6信号通路介导的神经炎症的影响[J].中国病理生理杂志,2022,38(9):1561-1568.

基金资助:河南省医学科技攻关计划联合项目(编号:LHGJ20191021);

文章来源:姜开洋,董莉丽,王艳荣,等.木犀草素对神经性疼痛模型大鼠MCP-1/CCR2信号轴的影响[J].山东中医药大学学报,2024,48(05):587-595.