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黄芩对脂多糖诱导的J774A.1炎症模型抗炎作用及机制

2025-08-12 63 上传者：管理员

摘要：目的分析黄芩对脂多糖（LPS）诱导的J774A.1巨噬细胞炎症模型的调节作用，并探讨其与MAPK信号通路（p38/ERK）的关系。方法本实验分为空白对照组，LPS组，黄芩20、40 mg·L-1，LPS加黄芩20、40 mg·L-1组。J774A.1给予LPS诱导，同时黄芩干预，共刺激24h后收集细胞，RT-PCR的方法检测白细胞介素（IL）-1β和 IL-10 mRNA的表达，Western blotting检测黄芩对p65、p38、ERK蛋白磷酸化表达的影响。结果黄芩可以降低由LPS诱导导致的炎症因子升高，降低LPS导致的p38，ERK磷酸化表达。结论黄芩可能通过抑制MAPK信号通路（p38和ERK）减轻LPS诱导的炎症反应。

关键词：
丝裂原活化蛋白激酶
抗肿瘤
炎症模型
细胞因子
黄芩
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黄芩为唇形科植物ScutellariabaicalensisGeorgi根,其提取物具有抗炎,抗病毒､抗肿瘤､抗氧化､抗菌等多种生物学功能,广泛应用于呼吸道感染､肺癌､结肠炎､肝炎及过敏性疾病的治疗[1]｡近年来,黄芩的活性成分引起了越来越多的关注,尤其是其抗肿瘤和免疫调节功能相关研究增多｡黄芩的主要活性成分为黄酮类化合物,如黄芩苷､汉黄芩素､枸杞子苷和黄芩素等,这些化合物能够直接作用于淋巴细胞､巨噬细胞､树突状细胞和单核细胞等,有效抑制炎症因子[如白细胞介素(interleukin,IL)-1β､IL-6､IL-8､肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)]生成,并减少一氧化氮(nitricoxide,NO)､前列腺素和活性氧等炎症介质的分泌[2-4]｡黄芩抗炎和免疫调节机制主要通过下调TOLL样受体､激活核因子-E2相关因子-2(nuclearrespiratotyfactor2,NRF2)与过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisomeproliferators-activatedreceptors,PPAR)信号通路,以及抑制核硫氧还蛋白系统及相关的信号通路[如丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)､蛋白激酶B(proteinkinaseB,Akt)､核因子κB(nuclearfactorkappa-light-chainenhancerofactivatedBcells,NFκB)和Janus激酶-信号转导子和转录激活子(Januskinase-signaltransducerandactivatoroftranscription,JAK-STAT)]实现[5]｡尽管黄芩的抗炎活性显著,但其在巨噬细胞的具体作用机制仍需进一步明确｡本研究利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导J774A.1小鼠单核巨噬细胞(J774A.1mousemononuclearmacrophage)建立炎症模型,探究黄芩对炎症因子IL-1β､NO释放以及抗炎因子IL-10mRNA表达的作用,报道如下｡

1、材料与方法

1.1细胞株

本研究选用小鼠巨噬细胞系J774A.1作为实验模型｡

1.2药物和主要试剂仪器

黄芩颗粒(江阴天江药业有限公司,每袋2.7g,相当于饮片5.94g,批号:2203042301),DMEM培养基(批号:C11995500BT)､青霉素和链霉素双抗(批号:15140-122)､胎牛血清[FetalBovineSerum(FBS),批号:10270-106],0.25%Trypsin-EDTA(货号25200-072,Gibco)､TRIZOL试剂[赛默飞世尔科技(ThermoFisherScientificInc,Invitrogen),批号:47303]､逆转录试剂盒[英杰生命技术公司(InvitrogenCorporation,Thermo),批号:00112927]､荧光定量PCR试剂盒(罗氏,批号TNF-α:68298);LPS[西格玛奥德里奇公司(Sigma-AldrichCo.LLC,sigma)]､一氧化氮检测试剂盒(Thermo,批号:TB229)｡Phospho-干扰素基因刺激因子(StimulatorofInterferonGenes,STING)(货号#50907),Phospho-TANK结合激酶1(TANKbindingkinase1,TBK1)(货号#5483),Phospho干扰素调节因子3(Interferonregulatoryfactor3,IRF3)(货号#4947),STING(货号#13647),HistoneH2A.XRabbitmAb(货号#9718),TBK1(货号#38066),IRF3(货号#11904)购自CellSignalingTechnology(CST)公司｡

2、方法

2.1细胞培养与实验分组

37℃､5%CO2条件下,用含10%FBSDMEM培养基对细胞进行常规培养｡本实验设置空白对照组､LPS对照组(10µg·mL-1)､LPS与低､中､高剂量黄芩干预组(黄芩浓度分别为0.05､0.5､5µg·mL-1)｡

2.2黄芩对巨噬细胞增殖的影响

在对数生长期,接种3×103个/孔J774A.1细胞于96孔细胞培养板,设定不同浓度的黄芩溶液(0.05､0.5､5､50μg·mL-1),处理24h后,加入MTT溶液(5mg·mL-1)继续培养4h｡弃去上清液,加入150μLDMSO,使用酶标仪在570nm波长处测量每孔吸光值｡

2.3黄芩对LPS诱导的J774.1A细胞IFNβ､TNF-α､IL-1β､CXCL10､CCL5和IFNβmRNA的影响

药物处理24h后,使用TRIZOL试剂收集细胞并提取RNA｡按照逆转录试剂盒说明书将1µgRNA逆转录为cDNA,利用cDNA为模板扩增诱导型一氧化氮合酶(inducibleNntricoxidesynthase,iNOS)､C-X-C基序趋化因子配体10(C-X-CMotifChemokineLigand10,CXCL10)､C-C基序趋化因子配体5(C-CMotifChemokineLigand5,CCL5)､干扰素β(Interferon-β,IFN-β)､IL1β､IFNγ､TNF-α)的mRNA｡引物序列,见表1｡按照实时荧光定量PCR(Real-timePCR)试剂盒说明书,反应体系为:2xSYBRGreen10μL､上下游引物终浓度0.4μmol·L-1,cDNA模板10μL,DEPC水12μL,反应总体系为20μL｡扩增程序设定为:95℃预变性10min,95℃变性15s,60℃退火34s,循环40次｡以GAPDH作为内参,采用2-△△CT法计算相对基因的表达量｡

表1引物序列

2.4黄芩对LPS诱导的NO的影响

将J774A.1细胞接种于96孔细胞培养板,以2×104个/孔密度培养,经过24h药物处理后,收集上清液,并使用格里斯试剂(Griess)检测NO释放量｡

2.5黄芩对LPS诱导的J774A.1AMAPK信号通路中p38和ERK蛋白磷酸化表达的作用

在不同剂量的黄芩干预下,加入终浓度10μg·mL-1LPS处理24h,收集细胞,使用裂解液裂解细胞并提取总蛋白｡再采用BCA法检测浓度,通过电泳检测p38丝裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activatedproteinkinase,p38)MAPK和细胞外信号调节激酶(extracellularsignal-regulatedkinase,ERK)蛋白的表达情况｡

2.6统计学方法

采用GraphPadPrism8软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示｡若数据符合正态分布和方差齐性,采用单因素方差分析进行多组间比较,组间两两比较采用t检验｡若数据不符合正态分布和方差齐性,则选用非参数值秩和检验｡以P<0.05为差异有统计学意义｡

3、结果

3.1黄芩对巨噬细胞增殖的影响

黄芩溶液在80μg·mL-1以下对巨噬细胞增殖的影响不显著,因此可以选用80μg·mL-1以内的浓度进行后续干预,以观察其在炎症模型中的作用｡同时,黄芩素20μg·mL-1以下对巨噬细胞的毒性作用较小,未对细胞活力造成明显影响｡见表2｡

表2黄芩对巨噬细胞增殖的影响

3.2黄芩对J774.A1巨噬细胞膜蛋白CD86､CD80､CD206､MHC-2表达影响

流式细胞术结果表明,在黄芩的作用下,J774A.1巨噬细胞中CD206表达显著增加,与空白对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)｡在脂多糖处理组中,CD86､CD80､MHC-2表达显著升高,经过黄芩处理后,这些标志物表达显著降低(P<0.05)｡见表3｡

表3黄芩对J774.A1巨噬细胞膜蛋白CD86､CD80､CD206､MHC-2表达影响(x±s,n=6

3.3黄芩对J774A.1细胞IL-1β､TNF-α､IL-6､iNOS､IL-10mRNA表达的影响本实验采用脂多糖作为炎症模型诱导因子,刺激J774A.1巨噬细胞24h以确认模型的有效性｡与空白对照组比较,IL-1β､TNF-α､IL-6､iNOSmRNA表达显著上升(P<0.05),表明成功构建炎症模型｡在不同剂量黄芩溶液处理下,与脂多糖组比较,脂多糖诱导的IL-1β､TNF-α､IL-6､iNOSmRNA表达显著降低,同时IL-10mRNA表达显著升高(P<0.01)｡见表4｡

表4黄芩对J774A.1细胞IL-1β､TNF-α､IL-6､iNOS､IL-10mRNA表达的影响(x±s,n=3)

3.4黄芩对巨噬细胞相关细胞因子的影响在巨噬细胞中,脂多糖作用可以显著增加IL1β､TNF-α和IL-6分泌(P<0.05)｡然而,在黄芩处理后,可以显著性抑制IL-1β､TNF-α､IL-6的表达,并增加IL-10的表达(P<0.05)｡见表5｡

表5黄芩对巨噬细胞IL-1β､TNF-α､IL-6､IL-10表达的影响(x±s,n=3)

3.5黄芩对J774A.1细胞及脂多糖诱导的J774A.1细胞NO释放的影响

与空白对照组比较,脂多糖显著增加巨噬细胞J774A.1分泌的NO,差异具有统计学意义(P<0.05)｡在黄芩单独作用于巨噬细胞的情况下,并未增加巨噬细胞分泌NO｡反之,能够显著降低脂多糖导致的NO水平的升高,差异具有统计学意义(P<0.05)｡见表6｡

表6黄芩对J774A.1细胞及脂多糖诱导的J774A.1细胞NO释放的影响(x±s,n=3)

3.6黄芩对脂多糖诱导的J774A.1细胞p-p38､p-ERK､p-p65蛋白表达的影响

探讨黄芩的可能的抗炎机制,选择与LPS刺激密切相关的细胞外信号调节激酶(extracellularsignal-regulatedkinase,AMPK)-p38MAPK,ERK和核因子κBp65亚基(nuclearfactorKappaBp65subunit,p65)｡LPS刺激后显著性增加了p38和ERK的磷酸化水平,而在黄芩干预后,这些磷酸化水平显著降低｡与LPS对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)｡这些结果表明黄芩具有抗炎作用,可能通过影响p-p38,p-p65和p-ERK蛋白的磷酸化表达,或许抑制LPS诱导的炎症反应,可能通过影响核因子κB(nuclearfactorkappa-B,NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)通路来实现｡见表7｡

表7黄芩对脂多糖诱导的J774A.1细胞p-p38､p-ERK､p-p65蛋白表达的影响(x±s,n=3)

4、讨论

巨噬细胞是一种极具异质性的细胞群体,在机体免疫平衡和防御中发挥关键作用[6]｡巨噬细胞主要分为经典活化的M1亚型和替代活化的M2型｡M1型巨噬细胞通常在受到IFN-γ､LPS､TNF-α等刺激下极化,其特征是高表达共刺激因子CD86和CD80等,在抗肿瘤和免疫调节中起重要作用[7]｡炎症是机体对各种有害刺激(如细菌､病毒､物理或化学因素)的正常生理反应[8]｡然而,过度或持续性的炎症反应可能引起组织损害及相关疾病[9]｡

LPS为一种常见的炎症刺激因子,可以有效诱导巨噬细胞释放炎症介质｡研究[10]显示,LPS刺激巨噬细胞可引起大量炎症介质和活性氧分子的释放,如TNF-α､IL-1β､IL-6､NO等,进而调节巨噬细胞的功能｡过量分泌炎症因子可能对机体造成损伤,而IL-10､转化生长因子-β(TransformingGrowthFactorbeta,TGF-β)､IL-35等免疫抑制分子具有明显的抗炎特征｡IL-10通过与其受体形成复合物,调节不同免疫细胞的功能[11]｡在单核细胞/巨噬细胞中,IL-10能减少炎症介质合成,增强抗原摄取[12]｡

中药黄芩广泛应用于多种疾病的治疗,具有良好的抗炎活性,常用于腹泻､痢疾､高血压､出血､失眠､炎症和呼吸道感染等[13]｡本研究结果显示,LPS诱导后,巨噬细胞炎症因子IL-1β､IL-6､iNOSmRNA显著增加,验证了炎症模型的有效建立｡黄芩干预后,这些相关炎症因子表达显著下降,同时抗炎因子IL-10的水平上升｡

综上所述,黄芩对炎症因子表达的调节可能是通过抑制MAPK信号通路中p38MAPK､ERK的活化发挥抗炎作用｡对LPS诱导的IL-1β表达具有抑制作用｡因此,黄芩可能通过抑制p38MAPK､ERK通路的活化调节相关基因的转录,降低炎症因子IL-1β､IL-6和活性氧等表达水平,发挥抗炎作用｡

参考文献:

[1]李平,胡建燃,史宝忠,等.黄芩多糖的提取及其抗氧化和抗肿瘤活性研究[J].生物技术通报,2021,37(4):155-163.

基金资助:广东省中医药管理局项目(20241285,20241290); 2024年广东省名中医传承工作室建设项目(粤中医办函[2023]108号);珠海市社会发展领域科技计划项目(2320004000290);

文章来源:江泽波,徐盼,黄东晖,等.黄芩对脂多糖诱导的J774A.1炎症模型抗炎作用及机制[J].长春中医药大学学报,2025,41(08):871-875.