蟾皮是蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizansCantor或黑眶蟾蜍Bufo melanosticusSchneider的干燥全皮，又称癞蟆皮、蟾蜍皮、干蟾皮[1]。蟾皮中化学成分相对复杂，主要有吲哚生物碱类、蟾毒内酯类、蟾蜍环酰胺类及其他类化合物[2-4]，蟾皮的有效成分主要为吲哚生物碱类(如5-羟色胺等)，具有抑菌活性，还可抑制TLR4/MyD88/MAPKs与TLR4/MyD88/NF-κB这两种信号通路，调节葡萄糖基神经酰胺(GluCer)和磷脂酰胆碱(PC)的脂质稳态，具有显著抗炎活性[5-8]；以及蟾毒内酯类(如华蟾酥毒基等)，除具有抑菌功效外还可通过抑制肿瘤细胞迁移或增殖、抑制肿瘤细胞血管生成以及诱导肿瘤细胞凋亡、分化等途径发挥抗肿瘤活性，此外还具有强心以及抗炎镇痛等功效[9-12]。

目前，蟾皮提取工艺优化的指标成分多为单一的蟾毒内酯类或蟾皮总生物碱类成分[13-15]，如何最大效率地提取蟾皮中的有效成分，同时以吲哚生物碱类和多种蟾毒内酯类成分含量为评价指标的提取工艺优化研究仍是空白。蟾皮中蟾毒内酯类成分的提取溶剂多为乙醇或者甲醇，本课题组经预试验发现，蟾皮乙醇提取物中吲哚生物碱的含量较高。王元清等[16-18]研究表明，蟾皮提取物中、高浓度的乙醇提取物较水提物具有较高的抑菌活性，且抑菌活性与吲哚生物碱的含量存在一定的量效关系。综合考虑，在本试验中采用乙醇对蟾皮进行提取。加热回流法提取效率高、操作简便，因此本试验采用正交试验对加热回流提取蟾皮中3种主要的蟾毒内酯类以及吲哚生物碱成分进行优化，并使用层次分析法对蟾毒灵等指标成分进行权重分析，确定蟾皮中有效成分的最佳提取工艺，并对提取物的抗菌活性进行分析，为蟾皮资源的开发与利用奠定基础。

1、材料

1.1 仪器

万分之一天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；Agilent 1260 高效液相色谱(安捷伦公司)；Alpha 1-4 LDplus冷冻干燥机(上海双旭电子有限公司)：高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技有限公司)；UV-6100型紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；高压蒸汽灭菌锅(上海施都凯仪器设备有限公司)。

1.2 材料

本试验所用蟾皮均购自山东日照市康宇中药材有限公司，经山东中医药大学张永清教授鉴定为中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizansCantor的干燥全皮。蟾毒灵(批号：P27F10F81703)、5-羟色胺(批号：S02HB193569)、脂蟾毒配基(C30S8G45143)、华蟾酥毒基对照品(批号：W27M10Z84297)(纯度均大于98%，上海源叶生物科技有限公司)；TTC 染色液(批号：J08HR11840A，上海源叶生物科技有限公司)；大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌(山东拓普生物工程有限公司)；乙醇、乙腈、甲酸(色谱纯，美国赛默飞世尔科技)。

2、方法与结果

2.1 蟾皮中有效成分的提取

干蟾皮剪碎后，粉碎机粉碎，粉末过60目筛。精密称定蟾皮粉末2.0 g，加入乙醇，加热回流进行提取，提取液以4000 r·min-1离心15 min，取上清液备用。

2.2 蟾毒内酯类成分含量的测定

2.2.1 色谱条件

安捷伦InfinityLab Poroshell 120 EC-C18(150 mm×3 mm，2.7 μm)色谱柱；流动相A为0.1%磷酸水，流动相B为乙腈，梯度洗脱(0～5 min，80%→75%A；5～20 min，75%→71%A；20～30 min，71%→65%A；30～50 min，65%→60%A)，柱温30℃，检测波长296 nm，流速0.5 mL·min-1，进样量5 μL，自动进样。

2.2.2 对照品溶液的配制

精密称定华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、蟾毒灵对照品适量，加无水乙醇溶解使其质量浓度为1 mg·mL-1，摇匀。

2.3 吲哚生物碱含量的测定

2.3.1 对照品溶液的配制

5-羟色胺对照品的配制方法同“2.2.2”项下。

2.3.2 蟾皮提取物中吲哚生物碱的含量测定

以5-羟色胺为对照品，采用紫外分光光度法进行含量测定[19]。精密量取样品溶液0.5 mL，置5 mL量瓶中，加1 mL 15%对二甲氨基苯甲醛溶液，提取溶剂定容至刻度线，摇匀，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察

取“2.2.2”项下与“2.3.1”项下溶液，加入无水乙醇配制不同浓度的对照品溶液，进样测定，绘制标准曲线。蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基和5-羟色胺的回归方程分别为：Y1=9.0219X1-22.927，r=0.9998；Y2=7.7877X2-4.723，r=0.9993；Y3=6.552X3-4.4513，r=1.000；Y4=0.0114X4-0.0111，r=0.9994，线性范围蟾毒灵为10～500 μg·mL-1、华蟾酥毒基为10～400 μg·mL-1、脂蟾毒配基类为10～400 μg·mL-1、5-羟色胺为2.5～60 μg·mL-1。

2.4.2 精密度试验

取“2.1”项下供试品溶液，在“2.2.1”项条件下连续进样测定6次，测得蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的平均含量分别为0.142、0.254、0.238 mg·g-1，RSD值均在1.2%～1.3%。取“2.1”项下供试品溶液，按“2.3.2”项下方法测定6次，测得吲哚生物碱的平均含量为4.986 mg·g-1，RSD值为0.78%，表明本试验所用仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验

取“2.1”项下供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h按照“2.2.1”项下和“2.3.2”项下方法测定蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基和吲哚生物碱含量，其RSD值分别为1.2%、2.0%、1.9%、2.2%，表明蟾皮供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.4 重复性试验

精密称取6份蟾皮，每份2 g，加80%乙醇40 mL，加热回流提取2次，每次2 h，离心取上清液。测定蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基和吲哚生物碱的平均含量，分别为0.164、0.260、0.246、5.59 mg·g-1，RSD值分别为1.8%、2.6%、1.9%、2.2%，表明方法重复性良好。

2.4.5 加样回收试验

取已知含量的蟾皮，平行6份，分别依次精密加入适量蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、5-羟色胺对照品溶液，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”和“2.3.2”项下方法进样测定，计算回收率，结果4种成分的回收率在95.45%～107.3%，RSD值在1.0%～2.9%。

2.4.6 专属性

吸取“2.1”项下蟾皮提取液及“2.2.2”项下蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，色谱图如图1所示，说明溶剂对指标成分的含量测定无干扰。

图1 蟾皮提取物中有效成分测定的专属性色谱图

2.5 层次分析法确定各指标权重系数

本研究以吲哚生物碱、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、蟾毒灵为指标成分，根据层次分析法确定各种指标成分的权重[20-24]。蟾皮与蟾酥中有效成分相似，主要为生物碱类和蟾毒内酯类。其中蟾皮中的生物碱类主要为吲哚类生物碱，在蟾皮中的含量较高，与蟾皮清热解毒和利水消肿功效密切相关[25]。在2020年版《中国药典》中以华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、蟾毒灵为蟾酥药材的含量测定成分[26]，与蟾酥相似，华蟾酥毒基在蟾皮中的含量高于脂蟾毒配基与蟾毒灵在蟾皮中的含量，因此将华蟾酥毒基与吲哚生物碱并列排名第一位，脂蟾毒配基排名第两位，蟾毒灵排名第三位，以此构成两两比较的判断优先矩阵，见表1，吲哚生物碱、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、蟾毒灵的权重系数分别为0.3507、0.3507、0.1892、0.1093，对各个权重系数进行一致性检验，得一致性指标CI=0.0034≠0，随机一致性比率CR=CI/RI=0.0037<0.1(RI、CR、CI分别为平均随机一致性指标、随机一致性比率、一致性指标)，表明判断矩阵具有较好的一致性，权重系数合理有效。综合评分Y=(0.3507×吲哚生物碱含量/吲哚生物碱含量最大值+0.3507×华蟾酥毒基含量/华蟾酥毒基含量最大值+0.1892×脂蟾毒配基含量/脂蟾毒配基含量最大值+0.1093×蟾毒灵含量/蟾毒灵含量最大值)×100。

表1蟾皮提取物中指标成分比较判断优先矩阵

2.6 单因素试验

固定料液比1∶20，提取时间2 h，回流次数1次，考察乙醇浓度分别为50%、60%、70%、80%、90%；固定乙醇浓度70%，回流提取1次，每次提取2 h，考察料液比分别为1∶8、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25；固定料液比1∶20，乙醇浓度70%，回流次数1次，考察回流时间0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h；固定料液比1∶20，乙醇浓度70%，回流时间2 h，考察回流次数1、2、3、4次，对蟾皮中吲哚生物碱、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、蟾毒灵指标成分提取效率的影响，结果见图2，故最终选择乙醇70%、80%、90%；料液比1∶15、1∶20、1∶25；回流时间1.5、2.0、2.5 h；回流次数1、2、3次进行后续工艺优化。

图2 蟾皮提取工艺单因素试验结果

2.7 正交试验设计

基于“2.6”项下结果，选择乙醇浓度(A)、料液比(B)、回流时间(C)、回流次数(D)为影响因素，采用L9(34)正交表进行蟾皮提取优化试验，结果见表2，方差分析结果见表3。4个因素对蟾皮指标成分提取效率影响大小为料液比(B)<回流时间(C)<回流次数(D)<乙醇浓度(A)，蟾皮提取最佳工艺为A2B3C3D3，即加25倍量浓度为80%乙醇，加热回流提取3次，每次2.5 h。由表3可知，因素A对蟾皮提取工艺的结果有显著影响(P<0.05)，而因素C、D无显著影响(P>0.05)。B2与B3、D2与D3对蟾皮提取效率的影响相差不大，结合蟾皮提取的综合评分和实际因素，将最优工艺调整为20倍量80%乙醇，回流提取2次，每次2.5 h。

表2蟾皮提取工艺正交试验结果

表3蟾皮提取工艺综合评分方法分析结果

2.8 验证试验

基于蟾皮最优提取工艺，进行3次验证试验，结果见表4，蟾皮指标成分的综合评分平均值为Y=93.24，RSD为0.46%<3%，并且在该条件下进行10倍放大提取，重复3次，结果表明蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基和吲哚生物碱的平均含量分别为0.1619、0.2365、0.2977、5.20 mg·g-1，RSD分别为0.69%、0.33%、0.99%、1.8%，表明该工艺具有良好的重复性及稳定性。

表4蟾皮提取工艺验证试验结果

2.9 最优工艺条件下蟾皮提取物的抗菌活性

对最优工艺条件下蟾皮提取液经浓缩、冷冻干燥后得到的干燥粉末进行抗菌活性评价。精密称定蟾皮提取液的干燥粉末，加入适量蒸馏水配成初始质量浓度为200 mg·mL-1的蟾皮提取物。参考文献[27-30]方法，在96孔板中，精密加入100 μL的LB液体培养基，在第一个孔中精密加入100 μL的蟾皮提取物，吹打混匀后，吸取100 μL至第2孔中，重复操作至第8孔，最后一孔吸取100 μL弃去，最终蟾皮提取物质量浓度分别为200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625 mg·mL-1。按LB液体培养基∶细菌悬液为20∶1的比例加入细菌悬液，第9孔加入200 μL的LB液体培养基，不加药液，观察试验菌是否正常生长，第10孔只加入200 μL的LB液体培养基，不加试验菌，观察培养基是否受污染。同板上设置卡那霉素(2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625 μg·mL-1)阳性对照组，混匀后37℃培养24 h后，加入TTC 染色液，颜色不变红者所对应的最低药物浓度为最小抑菌浓度(MIC)。在MIC前(含MIC)每孔中吸取5 μL溶液置96孔板中(含100 μL的LB液体培养基)，37℃培养24 h后加入TTC染色液，颜色不变红者所对应的最低药物浓度为最小杀菌浓度(MBC)。结果表明最优工艺条件下获得的提取物，对枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌均具有较好的抑制作用，MIC分别为6.25、12.5、12.5 mg·mL-1，MBC分别为12.5、50、25 mg·mL-1。阳性药物卡那霉素对枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的MIC分别为62.5、125、125 μg·mL-1，MBC分别为125、250、250 μg·mL-1。

3、结论与讨论

蟾皮中的有效成分主要为吲哚类生物碱和蟾毒内酯类成分。蟾皮中的生物碱类主要为吲哚类生物碱，在蟾皮中的含量相对较高，其代表成分有5-羟色胺，与蟾皮清热解毒和利水消肿功效密切相关，其次作为蟾蜍类药材，蟾皮与蟾酥中有效成分相似，药典中把华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、蟾毒灵作为蟾酥质量控制的指标成分，并且这3种成分在蟾皮蟾毒内酯类成分中含量相对较高，因此在蟾皮提取工艺的优化上，为了有效提取蟾皮中的活性成分，充分利用蟾皮药材，首次选择了吲哚生物碱以及蟾毒内酯类成分中的华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、蟾毒灵的含量为评价指标。通过单因素试验考察乙醇浓度、料液比、提取时间、提取次数对蟾皮中指标成分含量的影响，运用层次分析法确定各指标成分的权重系数，并结合单因素考察结果设计正交试验对蟾皮加热回流提取工艺进行优化，最终以乙醇浓度80%、料液比1∶20、加热回流2.5 h、提取 2次为最佳提取工艺，且验证试验结果显示，指标成分含量平均值分别为5.18、0.2365、0.2977、0.1622 mg·g-1，综合评分平均值为93.24分，RSD值为0.46%，表明该工艺稳定、可行，有效成分提取相对完全。

蟾皮具有清热解毒、利水消肿的功效，可治疗痈疽、肿毒等疾病，现代药理学表明蟾皮具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒等药理作用，目前关于蟾皮抗肿瘤、抗炎方面研究较多，其抑菌活性方面研究较少，因此选择对最优工艺条件下的蟾皮提取物进行抑菌活性研究，体外抑菌试验表明蟾皮提取物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌有较强的抑制作用。因此蟾皮有效成分提取工艺优化及其抑菌活性评价，可为后期蟾皮抑菌性能的开发和利用提供试验依据。

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基金资助:山东省重点研发(乡村振兴提振计划)项目(No.2022TZXD0035); 日照市重点研发计划项目(No.2021ZDYF010118);

文章来源:陈晶,胡晶红,郭媛媛,等.蟾皮有效成分提取工艺优化及其体外抑菌试验[J].中南药学,2024,22(10):2618-2623.