脑卒中已被世界公认为是致死和致残的三大原因之一，其中缺血性脑卒中（CIS）占卒中的80%以上，是降低人们生活质量的罪魁祸首之一。恢复血供是CIS的治疗首选，但是，血流再灌注会导致脑缺血再灌注损伤（CIRI），严重影响脑卒中的治疗及预后，近年成为缺血性脑卒中的研究热点。已知，CIRI的病理机制复杂，伴有兴奋性毒性、氧化应激、钙离子超载、炎症、凋亡等[1]。近年多项研究表明，细胞自噬（autophagy）和焦亡（pyroptosis）在CIRI中发挥着重要作用[2-3]。

自噬是细胞的一种自我保护，维持细胞内稳态[4-5]，能够控制、清除病原体，抑制炎症及凋亡等[6]。如张毅等[7]实验证实，黄芪甲苷可以上调自噬抑制凋亡对CIRI产生保护作用。焦亡是近期发现的一种新的、由多种炎症介质引发炎症反应产生的程序性细胞死亡模式[8-9]，目前研究最热的是炎性小体NLRP3介导的、由炎症介质引发的细胞焦亡[10-11]。越来越多证据表明，细胞焦亡参与脑缺血再灌注损伤[12-13]。

白藜芦醇（Res）是一种天然多酚类化合物，研究表明，Res预处理可以减轻脑缺血再灌注损伤[14]。既往研究已证实，Res通过促进自噬减轻脑缺血再灌注损伤[15];Res也可以抑制焦亡发挥神经保护作用[16]；但Res在减轻CIRI中自噬和焦亡的相互作用机制却没有明确。本实验将研究脑缺血再灌注中白藜芦醇调控自噬和焦亡的相互作用及其机制，为Res的神经保护作用提供理论依据，为临床治疗缺血性脑卒中提供参考。

1、材料与方法

1.1药品与试剂

Res(R5010）、2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyl-tetrazolium chloride solution,TTC)(17779）均购自Sigma公司；3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA)(S2767）购自Selleck公司；兔源beclin-1(MB0030）购于MB0030公司；兔源C3-Ⅱ（orb1677533）购于Biorbyt公司；兔源P62(EK-R39011）购于EK-Bioscience公司；兔源NLRP3(GTX133569）购于Gene Tex公司；兔源caspase-1(GTX101322）购于Gene Tex公司；兔源GSD-MD(CSB-EP009956HU）购于CUSABIO公司；兔源IL-1β(WM-YX13389）购于南京万木春公司；Triton X-100(9002-93-1）购于北京伊塔生物科技有限公司；兔源Z-YVAD-FMK(YZJ-4650）购于武汉纯度生物科技有限公司。

1.2实验动物

100只SD大鼠，7～8周龄，雄性健康，体质量200～230 g，购于山西医科大学（迎泽校区实验动物中心），许可证号为SCXK（晋）2019-0004。自由饮食，温度恒定为（22±1）℃，湿度保持为（50±20）%，自然采光，适应性饲养1周后进行分组造模。

1.3分组与给药

按照简单随机分组法，将大鼠分为7组：假手术（Sham）组、对照（Model）组、白藜芦醇干预（Res）组、3-甲基腺嘌呤（3-MA）组、Res+3-MA组、caspase-1抑制剂（Z-YVAD）组、Res+Z-YVAD组。剔除造模手术失败大鼠16只，平均每组12只。Sham组只做动脉分离，但不插入栓线，其余6组均做大脑中动脉栓塞（MCAO）造模手术，缺血2 h，再灌注24 h;Res组、Res+3-MA组、Res+Z-YVAD组造模手术7天前开始腹腔注射Res（用药前称重，60 mg/kg，溶于2 m L DMSO），第7天术前30 min给药一次。3-MA组、Res+3-MA组、Z-YVAD组、Res+Z-YVAD组在大鼠大脑中动脉退出栓线恢复血供30 min后按照实验设计分别腹腔注射药物3-MA(20 mg/kg，溶于1 m L DMSO）、Z-YVAD-FMK(10 mg/kg，溶于1 m L DMSO）。Sham组、Model组分别注射等量DMSO。

1.4制备大鼠大脑中动脉缺血/再灌注（MCAI/R）模型

参照文献[17]制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，10%水合氯醛（0.3 m L/100 g）腹腔注射大鼠，颈部剃毛后正中切口，顿性分离颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉，用手术线结扎颈总动脉和颈外动脉，用血管夹将颈内动脉远心端夹闭，眼科剪在颈总动脉远端的动脉壁上剪一小斜口，将线栓经颈总动脉至颈内动脉达大脑中动脉分叉处，固定线栓，线栓插入血管内20～22 mm。120min后退出线栓剪掉外露部分，缝合皮肤。

1.5神经功能缺损评分

采用Zea-Longa改良评分法对大鼠神经功能缺损进行评分，0分：无症状；1分：对侧前爪屈曲；2分：大鼠向左侧转圈；3分：行走时向一侧偏瘫倾斜；4分：无自发活动或意识障碍。

1.6脑梗死灶体积测定

取大鼠断头取脑，-20℃冷冻至硬，冠状位切6片，每片厚2 mm，置于2%氯化三苯基四氮唑染液中，避光37℃孵育30 min,4%多聚甲醛固定，拍照并保存分析，染色结果红色为正常脑组织，白色为梗死脑组织。采用Image J 7.0软件进行图像分析，计算脑梗死体积。相对脑梗死体积=（正常侧大脑半球体积-梗死侧非梗死区大脑半球的体积）/正常侧大脑半球体积%。

1.7免疫组化法

取脑，石蜡包埋，切片并梯度脱蜡，灭活内源性酶、热修复抗原，滴加一抗（1:1 000)4℃过夜，复温、清洗，加二抗（羊抗兔，1:1 000)30 min，加显色液20 min，苏木素核复染，封片，拍照，保存分析。显微镜拍照，并用Image J 7.0软件求得光密度值IOD，利用平均光密度值（AOD=Int Den/Area）表示脑组织中目的蛋白阳性表达情况。

1.8免疫荧光

取脑冰冻切片，血清封闭，加一抗，4℃孵育过夜；PBST浸洗切片处理后，加荧光二抗，37℃孵育1 h；抗体稀释比为：LC3-Ⅱ（1:500），荧光（Cy3）标记羊抗小鼠Ig G(1:500），检测抗体选用绿色荧光；NLRP3(1:500),caspase-1(1:500），荧光标记羊抗兔Ig G(1:500），抗体选择红色荧光；PBST浸洗切片，DAPI标本核染，含抗荧光淬灭剂的封片液封片，荧光显微镜观察：蓝色显示为细胞核，目标蛋白LC3-Ⅱ为绿色，目标蛋白NL-RP3、caspase-1均为红色。

1.9免疫印迹

免疫印迹法检测大鼠大脑局灶性缺血区皮质的蛋白表达：将大鼠深度麻醉后，提取大脑皮质50 mg，加入1.6 m L裂解液RIRA、研磨，12 000 r/min离心15 min,4℃，制作SDS凝胶、电泳及转膜，加入兔抗单克隆一抗（1:300）、4℃冰箱过夜，TBST洗膜，加山羊抗兔二抗（1:5 000），摇床慢摇1 h;TBST洗膜，ECT曝光，用Image J 7.0软件检测条带灰度值。

1.10统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件分析数据，计量资料用均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析，两组之间比较用独立样本t检验，以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2、结果

2.1白藜芦醇对CIRI大鼠神经功能的影响

各组大鼠神经功能缺损评分结果（Fig.1）显示，与Sham组比较，其余6组神经功能缺损评分均显著升高，说明脑缺血再灌注造模手术成功。与Model组比较，Res组、Res+3-MA组、Z-YVAD组、Res+Z-YVAD组神经功能缺损评分明显降低且差异具有统计学意义（P<0.01);3-MA组神经功能缺损评分明显升高（P<0.05）。与Res组比较，3-MA组神经功能缺损评分显著升高，差异具有统计学意义（P<0.01);Res+3-MA组神经功能缺损评分升高，差异具有统计学意义（P<0.01);Z-YVAD组神经功能缺损评分略有升高（P<0.05);Res+Z-YVAD组神经功能缺损评分明显降低，差异具有统计学意义（P<0.01）。

2.2白藜芦醇对CIRI大鼠脑损伤的影响

大鼠脑梗死体积百分比结果见Fig.2A-B，与Model组比较，Res组、Res+3-MA组、Z-YVAD组、Res+Z-YVAD组脑梗死体积百分比降低且差异具有统计学意义（P<0.01);3-MA组脑梗死体积百分比略升高（P<0.05）。与Res组比较，3-MA组梗死体积百分比明显升高，差异显著（P<0.01);Res+3-MA组、Z-YVAD组梗死体积百分比略升高，差异有统计学意义（P<0.01,P<0.05);Res+Z-YVAD组脑梗死体积百分比明显降低且差异有统计学意义（P<0.01）。

2.3免疫组化检测白藜芦醇对CIRI大鼠脑组织LC3-II、P62、NLRP3、caspase-1表达的影响

取大鼠缺血侧大脑额顶区皮质进行染色。与Model组比较，Res组、Res+3-MA组、Res+Z-YVAD组神经细胞LC3-II蛋白表达明显增加（P<0.01),P62、NL-RP3、caspase-1蛋白表达明显减少（P<0.01);3-MA组LC3-II蛋白表达减少（P<0.05),P62、NLRP3、caspase-1蛋白表达增加（P<0.01);Z-YVAD组LC3-II(P<0.05）、P62(P<0.01）、NLRP3(P<0.01）蛋白表达差异有统计学意义，caspase-1蛋白表达显著减少（P<0.01）。与Res组比较，3-MA组神经细胞LC3-II蛋白表达显著减少（P<0.01),P62、NLRP3、caspase-1蛋白表达显著增加（P<0.01);Res+3-MA组LC3-II蛋白表达明显减少（P<0.01),P62(P<0.05）、NLRP3(P<0.01）、caspase-1(P<0.01）蛋白表达增加；Z-YVAD组神经细胞LC3-II蛋白表达显著减少（P<0.01),P62、NLRP3蛋白表达显著增加（P<0.01),caspase-1蛋白表达减少（P<0.01);Res+Z-YVAD组神经细胞LC3-II、P62、NLRP3蛋白表达降低（P<0.05),caspase-1蛋白表达显著减少（P<0.01）。结果表明，Res可以诱导自噬激活，同时减少炎症小体形成进而抑制细胞焦亡（Fig.3）。

2.4免疫荧光检测白藜芦醇对CIRI大鼠脑组织Beclin-1、NLRP3、caspase-1表达的影响

取大鼠缺血侧脑额顶区皮质进行免疫荧光染色，与Model组比较，Res组、Res+3-MA组、Res+Z-YVAD组脑组织Beclin-1蛋白平均吸光度明显增加（P<0.01),NLRP3、caspase-1蛋白平均吸光度明显减少（P<0.01);3-MA组Beclin-1蛋白平均吸光度减少（P<0.05),NLRP3、caspase-1蛋白平均吸光度增加（P<0.05);Z-YVAD组神经细胞Beclin-1、NLRP3蛋白平均吸光度（P<0.05),caspase-1蛋白平均吸光度明显减少（P<0.01）。与Res组比较，3-MA组脑组织Beclin-1蛋白平均吸光度显著减少（P<0.01),NLRP3、caspase-1蛋白平均吸光度显著增加（P<0.01);Res+3-MA组Beclin-1蛋白平均吸光度明显减少（P<0.05),NLRP3、caspase-1蛋白平均吸光度明显增加（P<0.05);Z-YVAD组神经细胞Beclin-1蛋白平均吸光度显著减少（P<0.01),NLRP3蛋白平均吸光度显著增加（P<0.01),caspase-1蛋白平均吸光度明显减少（P<0.01);Res+Z-YVAD组神经细胞Beclin-1、NLRP3蛋白平均吸光度明显减少（P<0.05),caspase-1蛋白平均吸光度显著减少（P<0.05）。结果表明，Res可以诱导自噬激活，同时减少炎症小体形成并抑制细胞焦亡（Fig.4）。

2.5白藜芦醇对CIRI大鼠大脑皮质自噬相关蛋白与焦亡标志蛋白表达变化的影响

与Model组比较，Res组、Res+3-MA组、Res+Z-YVAD组神经细Beclin-1、LC3-II蛋白表达明显增加（P<0.01),P62、NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β蛋白表达明显减少，差异具有统计学意义（P<0.01);3-MA组Beclin-1、LC3-II蛋白表达减少（P<0.05),P62、NL-RP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β蛋白表达增加（P<0.05);Z-YVAD组Beclin-1、LC3-II(P<0.05）、P62(P<0.01）、NLRP3蛋白表达变化明显减少（P<0.05),caspase-1、GSDMD、IL-1β蛋白表达显著减少（P<0.01）。与Res组比较，3-MA组神经细胞Beclin-1、LC3-II蛋白表达显著减少（P<0.01),P62、NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β蛋白表达显著增加（P<0.01);Res+3-MA组Beclin-1、LC3-II蛋白表达减少（P<0.05),P62(P<0.05）、NLRP3(P<0.05）、caspase-1、GSDMD、IL-1β蛋白表达增加（P<0.01);Z-YVAD组神经细胞Beclin-1、LC3-II蛋白表达显著减少（P<0.01),P62、NLRP3蛋白表达显著增加（P<0.01),caspase-1、GSDMD、IL-1β蛋白表达减少（P<0.01);Res+Z-YVAD组神经细胞Beclin-1、LC3-II、P62、NL-RP3蛋白表达变化明显（P<0.05),caspase-1、GSD-MD、IL-1β蛋白表达显著减少（P<0.01,Fig.5）。

3、讨论

缺血性脑卒中是一种发病率、致残率和死亡率均高的急性脑血管疾病，缺血再灌注损伤是其治疗过程中的重要难题。CIRI的病理生理机制十分复杂，一方面因能量衰竭、大量自由基产生、细胞凋亡等导致脑组织损害；另一方面，机体启动内源性神经保护及修复再生机制，减轻脑组织损害，促进脑组织修复及再生，多种生理病理机制相互作用[18]。但这种内源性自我保护及神经修复能力有限，不足以促进神经功能的恢复[19]。因此，寻找具有神经保护和神经修复的药物具有重要的临床价值。白藜芦醇就是我们有幸找到的一种可以利用多种机制联合作用的药物。白藜芦醇是一种天然的、植物提取的多酚类化合物，预处理或后处理可通过抗氧化、抗自由基、抗凋亡等途径减轻缺血性脑损伤[20]，但其机制并不明确。

近来研究证实，在多种原因引起的脑缺血再灌注过程中，自噬激活可降解受损细胞器，维持细胞内稳态及细胞产物的合成和循环再利用，因此，自噬被认为是一种重要的保护机制[21-22]。实验证实，在大鼠脑缺血再灌注期间自噬减少会加重脑损伤[23]。Beclin-1是自噬关键调控蛋白，参与早期自噬体膜的形成[24];LC3包含微管关联蛋白I和II，在自噬过程中，LC3-I会被包括Atg7和Atg3在内的泛素样体系修饰和加工，与磷脂酰乙醇胺（PE）相偶联，形成LC3-II并定位于自噬体内外膜上，是自噬的分子标志物[25]。p62(sequestosome-1,SQSTM1）是一种参与自噬的重要的选择性自噬衔接蛋白[26]，具有多个功能结构域，分散存在于细胞质中[27]。在本实验中，与模型组比较，白藜芦醇治疗可以增加Beclin-1、LC3-II蛋白表达，降低p62蛋白表达，提示白藜芦醇可能通过诱导自噬发挥神经保护作用。

细胞焦亡是一种炎症性程序性细胞死亡形式，是参与缺血再灌注损伤的重要病理机制[28]。caspase-1是细胞焦亡途径中的主要效应蛋白酶，因此caspase-1的活化是细胞发生焦亡的重要指标[8]。炎症体的刺激导致caspase-1的加工和激活，激活的caspase-1切割成孔蛋白Gasdermin D（由GSDMD编码）作用于细胞膜并成孔，caspase-1将pro-IL-1β等切割为成熟形式并由细胞膜孔释放以诱发细胞炎症反应[29-30]。NLRP3炎性小体是一种在胞质内合成的蛋白复合体，在经典焦亡途径的启动和激活中都起到关键作用[31]。在本实验中由多个实验结果得出，与模型组比较，白藜芦醇治疗明显减少焦亡相关蛋白NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β表达，表明白藜芦醇减轻脑缺血再灌注损伤的病理机制可能与激活自噬，抑制焦亡有关。

在缺血再灌注病理变化下，自噬介导多个蛋白和信号通路的调控。据报道，缺血-再灌注损伤可激活神经元自噬，且高水平的自噬与缺血神经元焦亡密切相关[32]。在本实验中，加入3-MA产生与Res治疗相反作用；加入Z-YVAD（焦亡关键蛋白caspase-1的抑制剂）后，在Res治疗同时自噬水平变化不明显，焦亡进一步减少，与Res治疗效果一致，提示Res治疗大鼠脑I/R损伤可能通过激活自噬、自噬影响焦亡发挥作用。有文献报道，桃红四物汤（TSD）通过促进自噬抑制NLRP3炎症小体的激活，减少促炎因子的释放，从而减轻心肌缺血再灌注损伤[33]。亚低温可能通过ROS/NLRP3炎症小体通路介导上调自噬抑制焦亡，减轻CIRI[34]。综上所述，在脑缺血再灌注过程中，Res可能通过激活自噬、抑制焦亡发挥神经保护作用。

p62/SQSTM1是一种对泛素化靶标蛋白进行自噬降解的选择性受体，随着自噬抑制[35]水平的增加，p62/SQSTM1表达增加。大量的p62可以阻断核因子红细胞系2相关因子2(Nrf2）泛素化，转录激活Nrf2，然后激活的Nrf2与下游抗氧化反应元件（ARE）如血红素加氧酶-1(HO-1）结合，启动Nrf2/ARE信号通路[36]。Nrf2/ARE通路通过抑制ROS的形成，对缺血再灌注引起的焦亡具有保护作用[37-38]。以上研究提示，自噬可能通过p62/Nrf2/ARE通路调控焦亡的发生。本课题组将进一步研究，在Res减轻脑缺血再灌注损伤的病理机制中，自噬是否也通过p62/Nrf2/ARE通路调控焦亡的发生。

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基金资助:吕梁市重点社会发展项目(2021SHFZ-2-102); 山西医科大学汾阳学院科技扶持项目(2019C03); 大学生创新创业训练项目(FDC202210);

文章来源:张小良,高赛红,杨迎春,等.白藜芦醇激活自噬抑制焦亡减轻脑缺血再灌注损伤[J].中国临床药理学与治疗学,2024,29(11):1240-1248.