黄芪为豆科植物蒙古黄芪[Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus (Bge.) Hsiao]或膜荚黄芪[Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.]的干燥根，是传统的补气药材[1]。黄芪含有多种化学成分，其中主要有效成分为黄酮类、皂苷类和多糖类[2]。同时，现代药理研究表明，黄芪中的黄酮类物质可以通过直接清除自由基，抑制产生自由基酶活性、抑制自由基产生等途径发挥抗氧化作用[3]；谷海媛等[4]结合质量标志物（Q-Marker）概念对黄芪的Q-Marker进行预测分析发现，黄芪多糖、毛蕊异黄酮、槲皮素、刺芒柄花素、山柰酚、芒柄花苷、正己醛可作为黄芪质量标志物的参考。

中药在采收、加工及贮藏过程中易出现霉变等问题，其中黄芪在贮存过程中因微生物污染导致的霉变损失占5%～10%[5]。灭菌是中药生产的重要环节，在常用的中药灭菌方法中，湿热灭菌过程中的水蒸气会造成中药化学成分含量变化[6]；环氧乙烷灭菌易产生溶剂残留，进而造成污染[7]；钴-60辐照灭菌存在放射性污染，且更换放射源的成本高[8]。电子束辐照灭菌因灭菌效果好、穿透力强、绿色环保和高效能优势而被多个国家批准并广泛应用于食品加工领域[9]。王钢等[10]研究麦冬、大黄饮片的电子束辐照灭菌工艺发现，辐照剂量8 kGy以下的电子束辐照对麦冬、大黄饮片的质量无明显影响。王回霞等[11]研究发现，不同剂量的电子束辐照对藏药唐古特铁线莲主要活性成分无显著影响。但电子束辐照灭菌对黄芪质量的影响鲜见研究。中药质量评价的常用方法包括色谱法与光谱法。其中，表面增强拉曼光谱（surface-enhanced raman spectroscopy,SERS）法因灵敏度较高、操作简单、成本低，以及可获取药材中特有的指纹信息，已被用于检测中成药保健食品中的违法添加，但在中药复杂体系检测中的应用较少。黄浩等[12]通过SERS对不同产地的黄芪进行鉴别分析，发现拉曼光谱可对糖类、蛋白质类等大分子物质进行检测。高效液相色谱法（high performance liquid chromatography,HPLC）是常用的中药质量检测方法，于明等[13]发现HPLC指纹图谱可以较准确地评价电子束灭菌对天麻粉中物质含量的影响。拉曼光谱的指纹图谱与HPLC指纹图谱联动分析可更完整地表征中草药中的各类化学成分，更加全面准确地评价电子束辐照灭菌前后黄芪质量的变化。本研究采用SERS法及HPLC法，以灭菌率、SERS指纹图谱、HPLC指纹图谱、化学含量测定和抗氧化活性为指标，多维度综合评价电子束灭菌对黄芪质量的影响，旨在为电子束灭菌技术在黄芪药材加工、贮藏中的应用提供依据。

1、材料与方法

1.1 材料与试剂

黄芪饮片，购自吉林省长春市各辖区药房；对照品毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、刺芒柄花素、芒柄花苷（纯度均大于98%），购自成都瑞芬思生物科技有限公司；乙腈（色谱纯），美国TEDIA；甲酸（色谱纯），北京化工厂；2,2-联苯基-1-苦基肼基（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH）、3-氧代-2苯基-4,4,5,5-四甲基咪唑啉-1氧（2-phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-3-oxide-1-oxyl,PTIO），纯度大于98.5%，上海麦克林生化科技有限公司；水为超纯水，自制；大鼠星状肝细胞（hepatic stellate cells-T6,HSC-T6）、优质胎牛血清、双抗灭菌液、细胞培养级磷酸缓冲盐溶液、Dulbecco改良Eagle培养基/Ham’s F-12、体积分数0.25%胰酶消化液（含乙二胺四乙酸，PhenoRen改良型）、细胞培养级二甲基亚砜，均购自大连美仑生物技术有限公司。

1.2 主要仪器与设备

VF-PROACCEL高能直线电子加速器，10 MeV/20 kW，通化金汇药业股份有限公司；LC-15C高效液相色谱仪，日本岛津公司；HC-C18 Agilent色谱柱，美国安捷伦科技有限公司；Waters SYNAPT G2超高效液相色谱-四极飞行时间质谱联用仪，美国Waters公司；KQ-500E超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司；UV-1801紫外分光光度计，北京瑞利分析仪器公司；inVia型显微共聚焦拉曼光谱仪，英国雷尼绍（Renishaw）公司；RamTracer-200-QCM便携式拉曼光谱仪，欧普图斯（苏州）光学纳米科技有限公司；手持式拉曼光谱仪，上海如海光电科技有限公司；SW-CT-2F净化工作台，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；XH-C涡旋仪，常州迈科诺仪器有限公司；HF15IUV二氧化碳培养箱，上海力申科学仪器有限公司；TG18G科析离心机，金坛市科析仪器有限公司；HH-1数显恒温水浴锅，常州市江南实验仪器厂；QL-902真空压力泵，海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品辐照处理

黄芪样品经粉碎后过50目筛，用自封袋封装，每袋约200 g，送至通化金汇药业股份有限公司进行辐照处理。辐照吸收剂量分别设定为2、4、6、8、10、12、14、16、18 kGy，以未辐照样品作为对照。

1.3.2 微生物水平测定

按《中华人民共和国药典2020年版四部》[14]“非无菌产品微生物限度检查法（通则1105）”，分别检测霉菌和酵母菌总数、需氧菌总数及控制菌（大肠埃希菌、沙门菌、耐胆盐革兰阴性菌），平行测定3次。

1.3.3 银溶胶及样品溶液的制备

按照盐酸羟胺还原硝酸银方法[15]将4.5 mL 0.1 mol·L-1的氢氧化钠溶液加入到5 mL 0.06 mol·L-1的盐酸羟胺中，搅拌均匀后添加至90 mL 1.1×10-3mol·L-1的硝酸银溶液中，持续搅拌直至得乳灰色溶液。用离心机于10 000 r·min-1离心10 min，去上清液，得浓银胶溶液。将黄芪饮片粉碎成细粉，取1 g加10 mL甲醇超声15 min,5 000 r·min-1离心10 min后取上清液；滤渣加水10 mL二次超声提取15 min，离心10 min后取上清液。将两次的上清液合并后冷冻干燥，加入水1.25 mL溶解，得样品溶液。

1.3.4 黄芪SERS检测

将银溶胶与样品溶液按体积比1∶1混合，取20µL混和溶液滴于铝板上，采用显微共聚焦拉曼光谱仪、便携式拉曼光谱仪与手持式拉曼光谱仪分别获取黄芪饮片的表面增强拉曼光谱，并导入Labspec 5.5软件中进行分析。显微共聚焦拉曼光谱仪与便携式拉曼光谱仪：激光光源波长633 nm，激光功率200 mW，取谱范围200～1 800 cm-1，积分时间10 s。手持式拉曼光谱仪：激光光源波长500 nm，激光功率200m W，取谱范围200～1 800 cm-1，积分时间10 s。

1.3.5 供试品及对照品溶液的制备

称取黄芪饮片粉碎后的细粉1.25 g，加入体积分数为70%的甲醇25 mL回流提取1 h，提取2次并过滤，合并两次的滤液，蒸干，定容至25 mL，用0.45µm微孔滤膜滤过，即得供试品。精密称取毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、刺芒柄花素、芒柄花苷4种对照品各5 mg，加体积分数为70%的甲醇，配制成质量浓度为0.05 mg·mL-1的对照品溶液。

1.3.6色谱条件

选用HC-C18 Agilent色谱柱（4.6 mm×250 mm）；流动相为乙腈（A)-0.2%甲酸水（B）；二元梯度洗脱条件为0～40 min,15%～60%A;40～55 min,60%～75%A;55～56 min,75%～15%A;56～60 min,15%A；总流速为1.0 m L·min-1；柱温40℃；检测波长280 nm；进样量10µL[16]。

1.3.7 质谱条件

电喷雾离子源（electro-spray ionization,ESI）；正负离子检测模式；样品锥电压35 V；喷雾电压正离子3 000 V；负离子2 400 V；源温150℃；去溶剂气为氮气；温度300℃；流速300 L·h-1。

1.3.8 DPPH·清除能力的测定

取供试品溶液适量，加入体积分数为70%的甲醇，配制成质量浓度分别为7、6、5、4 mg·mL-1的浓度系列。参照朱敏等[17]的方法，检测黄芪甲醇提取液的DPPH·清除能力。平行测定3次，取平均值。

1.3.9 铁氰化钾还原能力的测定

按照王存琴等[18]的方法，测定10 mg·mL-1样品溶液的铁氰化钾还原能力。平行测定3次，取平均值。

1.3.1 0 PTIO·清除能力的测定

将供试品溶液用体积分数为70%的甲醇稀释至5、10、15、20 mg·mL-1，得样品溶液。参照王钦波等[19]的方法测定黄芪提取液的PTIO·清除能力。平行测定3次，取平均值。

1.3.11细胞存活率的测定

按体积比89∶10∶1将培养液、胎牛血清和双抗调配为完全培养基。按照“1.3.3”中的方法得吸收剂量为10 kGy的黄芪提取物后，用完全培养基分别调配成浓度为2 000、1 000、500、250、125µg·mL-1的黄芪样品溶液。将大鼠肝星状细胞（HSC-T6细胞）接种于含完全培养基的培养瓶中，将培养瓶置于温度37℃、CO2浓度5%的培养箱中培养。在无菌条件下分别吸取100µL供试品溶液，经无菌滤膜过滤后加入细胞中作为给药组，对照组每孔加入100µL新鲜培养液，每组受试物设6复孔，分别培养24、48、72 h。使用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT）法[20-21]测定450 nm处的吸光度（optical density,OD）。细胞存活率的计算参见以下公式：

式中，OD1为给药组的平均OD值；OD2为对照组的平均OD值。

1.4 数据处理

采用Labspec 5.5及Origin 2019软件绘图，运用多重比较及t检验进行显著性分析。将不同吸收剂量灭菌后黄芪样品（质量浓度为10 mg·mL-1)DPPH·清除率、PTIO·清除率及铁氰化钾吸光度分别作为母序列，13个共有峰的峰面积为子序列，导入SPSS软件中进行灰色关联度分析，采用均值法进行处理[22]。

2、结果与分析

2.1 灭菌前后微生物限度检查

由表1可知，未经辐照灭菌处理样品的微生物水平严重超标。当吸收剂量为2、4、6、8 kGy时，需氧菌、霉菌及酵母菌数量超出《中华人民共和国药典2020年版四部》[14]规定；当吸收剂量≥10 kGy时，需氧菌、霉菌及酵母菌数量均符合该药典规定，沙门菌未被检出；当吸收剂量≥4 kGy时，大肠埃希菌未被检出。以上表明，电子束辐照灭菌对黄芪中需氧菌、霉菌及酵母菌、大肠埃希菌和沙门菌均有抑制作用，且吸收剂量≥10 kGy时，各项微生物水平均符合该药典规定。

2.2 SERS定性分析

2.2.1 黄芪提取液与黄芪饮片SERS图谱的比较

由图1可知，相比黄芪提取液，黄芪饮片的SERS图谱只能分辨出少量的黄芪特征峰，更多特征峰被淹没在荧光信号杂峰中。黄芪经提取后，上述情况被有效改善。

2.2.2 显微共聚焦、便携式及手持式拉曼光谱仪结果比较

将3台仪器所得数据导入Labspec 5.5软件并扣除荧光背景，结果见图2。3台仪器对应SERS图谱均在548、638、733、828、960、1 028、1 126、1 246、1 334、1 402、1 460、1 610 cm-1处出现明显的拉曼特征峰，其中在733及1 334 cm-1处均出现很强的拉曼峰。以上表明，拉曼光谱仪的激发波长影响拉曼谱线的强弱，但谱线的呈现基本一致。由于手持式拉曼光谱仪的便携性更好、适合生产操作，本研究采用该光谱仪进行研究。

2.2.3 SERS指纹图谱的建立与分析

将不同吸收剂量的黄芪SERS数据导入Labspec5.5软件，分析结果见图3。由表2黄芪SERS峰的初步归属[23-26]可知，糖类、氨基酸结构、蛋白质的β折叠与无规卷曲结构、蛋白质的酰胺Ⅰ带、黄酮类化合物结构引起的谱线分别出现在402、482、1 460 cm-1,548、828 cm-1,1 246 cm-1,1645～1 690 cm-1,733、1 050、1 334、1 494 cm-1。通过共有峰峰面积评价谱图的相似度发现，不同吸收剂量下与灭菌前的SERS谱图相似度均大于0.900，表明黄芪经不同吸收剂量灭菌后质量稳定。

表1 微生物水平检查

图1 黄芪饮片、黄芪提取液的SERS图谱

图2 不同仪器测得的黄芪SERS图谱

图3 不同吸收剂量黄芪SERS指纹图谱

表2 黄芪SERS峰初步归属

2.3 化学成分定量分析及HPLC指纹图谱

2.3.1 化学成分定量分析

采用“1.3.6”条件获得对照品图谱，计算化学成分含量，结果见表3。多重比较分析发现，不同吸收剂量灭菌后样品中4种化学成分含量与空白无显著差异，吸收剂量为12、14 kGy时的总含量与空白（吸收剂量为0）差异显著。

2.3.2 HPLC指纹图谱的建立与分析

将黄芪的HPLC数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，得到不同吸收剂量灭菌后黄芪的指纹图谱。结合光电二极管矩阵检测器（diode array detector,DAD）给出的色谱峰的紫外图谱，以未灭菌的指纹图谱为参照，经标记峰（Mark峰）比对确定的13个共有峰见图4。相似度分析表明，不同吸收剂量辐照与对照的指纹图谱相似度均在0.900以上，表明灭菌前后样品化学组成的一致性良好、质量稳定[27]。

2.4 13个共有峰的结构确认

由电子附图1可知，在ESI正离子模式下，[M+H]+峰比较明显，信号强度明显强于负离子模式，因此化合物裂解特征分析主要采用正离子模式。根据黄芪对照品裂解的碎片离子信息，经NCBI数据库检索及文献[28-29]对比，推断13个共有峰的结构，确定13种成分均为黄酮类物质，结果见表4。

表3 化学成分含量测定结果

图4 黄芪HPLC指纹图谱和共有峰图谱（R)

表4 13个共有峰结构分析

2.5 黄芪抗氧化活性

由表5可知，不同吸收剂量灭菌后样品的DPPH抗氧化活性半抑制浓度、PTIO抗氧化活性半抑制浓度、铁氰化钾吸光度值较灭菌前无显著差异，表明电子束辐照对黄芪抗氧化活性无明显影响。

表5 黄芪抗氧化活性的测定结果

2.6 谱效关系分析

由表6可知，13个共有峰与3种抗氧化活性的关联度（r）均大于0.600。结合LC-MS分析结果可知，13种化合物均为黄酮类物质，表明黄酮类化合物是黄芪抗氧化功效的重要成分之一。4种化合物的抗氧化活性关联度从大到小依次为毛蕊异黄酮、芒柄花苷、毛蕊异黄酮苷、刺芒柄花素，对应关联度分别为0.854、0.851、0.829、0.736，表明相关性较强，可作为抗氧化的质量标志物。

表6 谱效关系分析结果

2.7 MTT法测定的细胞存活率

由表7可知，灭菌前后24、48、72 h内的细胞存活率均大于50%，相同给药浓度细胞存活率的t检验结果均无显著差异（P>0.05）。

表7 细胞存活率测定及t检验结果

3、讨论

本研究结果表明，电子束辐照可有效降低黄芪中的微生物含量，吸收剂量10 kGy及以上时可达到《中华人民共和国药典2020年版四部》[14]规定。而王钢等[10]研究发现，2 kGy的电子束辐照可使麦冬的微生物含量降至检测限以下，大黄则需4 kGy可达到检测限以下。其中，黄芪需更高剂量可能是由于黄芪药材初始微生物负载更高。根据《中药辐照灭菌技术指导原则》的相关规定[30]，结合本研究结果，确定黄芪电子束灭菌最佳吸收剂量为10 kGy，可为电子束灭菌技术在生产中的应用提供科学依据。

本研究发现，拉曼光谱能够展现不同样本间的细微差别且具有良好的指纹性，并通过SERS法初步确定了糖类、蛋白质和黄酮类物质的特征谱线。不同吸收剂量电子束辐照前后黄芪的SERS指纹图谱与HPLC指纹图谱间的相似度均大于0.900，表明黄芪灭菌后的化学成分无明显变化。戈雅倩等[31]发现，肉豆蔻经电子束灭菌后，其指纹图谱、总黄酮含量较未灭菌样品无显著差异，与本研究结果类似。鉴于黄酮类化合物是黄芪重要的抗氧化有效成分之一，本研究进一步考察了不同吸收剂量电子束辐照灭菌对毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、刺芒柄花素含量的影响，发现灭菌前后的上述指标含量无显著差异，表明黄酮类化合物在电子束辐照下较为稳定。滕宝霞等[32]对比钴-60、臭氧、环氧乙烷、紫外、湿热灭菌对黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的影响，发现5种灭菌方法对毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量均有影响，而钴-60灭菌相对影响较小，表明毛蕊异黄酮苷经辐照后较为稳定，与本研究结果类似。以上研究结果表明，适宜剂量的电子束辐照对黄芪的整体质量无显著影响。

本研究考察了2～18 kGy吸收剂量电子束辐照灭菌后的黄芪DPPH·清除率、PTIO·清除率及铁氰化钾还原力，多重比较表明黄芪灭菌后的3个抗氧化活性指标均与灭菌前无显著差异。付孟等[33]发现吸收剂量在25 kGy以下的电子束辐照对大黄的抗氧化活性无明显影响，与本研究结果一致。以上证实，电子束灭菌对中药材中的主要抗氧化活性物质如黄酮类物质、多糖等无明显影响。谱效关系研究发现，毛蕊异黄酮、芒柄花苷、毛蕊异黄酮苷、刺芒柄花素为黄芪中重要的抗氧化活性物质。张鑫等[34]运用密度泛函理论对黄芪抗氧化活性进行研究，发现上述4种物质具有较强的抗氧化活性，是黄芪中的主要抗氧化活性物质，与本研究结果一致，表明该4种物质可作为黄芪抗氧化活性质量标志物。

4、结论

电子束辐照灭菌后黄芪的微生物水平、4种化合物含量、3种抗氧化活性、SERS指纹图谱及HPLC指纹图谱分析结果显示，吸收剂量18 kGy及以下的电子束灭菌对黄芪质量无影响。结合辐照灭菌的相关规定，建议黄芪电子束辐照灭菌剂量不超过10 kGy。黄芪细胞存活率测定结果显示，10 kGy的电子束辐照灭菌对黄芪安全性无影响。谱效关系结果表明，毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、刺芒柄花素可作为黄芪抗氧化活性标志物。

参考文献:

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典2020年版一部[M].北京:中国医药科技出版社,2020

[2]李博,耿刚.黄芪的化学成分与药理作用研究进展[J].中西医结合研究,2022, 14(4):262-264

[3]侯敏娜,侯少平,胡亚茹,杨枫玉.黄芪总黄酮体外抗氧化性及抑菌活性的研究[J].华西药学杂志,2022, 37(4):380-384

[4]谷海媛,刘杰,马双成,王淼,高慧媛,郑健.黄芪的研究进展及其质量标志物的预测分析[J].中国药事,2023, 37(10):1180-1192

[6]张立雯,林玲,梁伟洪,陈伟盛,简敏骞,林彤,江英桥.干热､湿热､辐照对龙胆和秦艽化学成分和灭菌效果的比较研究[J].中药新药与临床药理,2016, 27(5):692-697

[7]孔祥山,邵晓慧,林海岩.中药制剂灭菌技术的应用初探[J].山东医药工业,2002(1):39-40

[8]林彤,毕福钧,吕渭升,张立雯,金红宇,马双成,江英桥.中药的辐照灭菌现状与监管[J].中国药学杂志,2019, 54(17):1442-1447

[9]蓝碧锋.电离辐照技术在食品工业中的应用及其安全性研究[C]//广东省食品学会.现代食品工程与营养健康学术研讨会暨2020年广东省食品学会年会论文集.广州:广州辐锐高能技术有限公司广东省工业钴-60伽玛射线应用工程技术研究中心,2020:52-58

[10]王钢,王丹,何毅,付孟,唐艺文,青川,高鹏,黄敏.麦冬､大黄饮片电子束辐照灭菌工艺研究[J].核农学报,2022, 36(8):1579-15

[11]王回霞,谢和兵,尼玛次仁,白玛旦增.电子束辐照对藏药唐古特铁线莲主要活性成分及灭菌效果的影响[J].核农学报,2024,38(2):289-297

[12]黄浩,李洁,陈荣,冯尚源,林居强,黄祖芳,李永增,陈炜炜,俞允,林多,林佳.拉曼光谱结合统计分析对不同产地黄芪饮片的鉴别分类研究[J].福州大学学报(自然科学版),2014, 42(4):646-652

[13]于明,王丹,王钢,高鹏,黄敏.电子束辐照对天麻粉灭菌效果及品质的影响[J].核农学报,2022, 36(11):2175-2182

[14]国家药典委员会.中华人民共和国药典2020年版四部[M].北京:中国医药科技出版社,2020

[16]陈伯丛,王汝上,罗德祥.不同产地黄芪总黄酮HPLC指纹图谱研究[J].北方药学,2016, 13(7):8-10

[17]朱敏,姚毅.何首乌炮制前后及其主要成分体外抗氧化活性研究[J].中国医院药学杂志,2018, 38(20):2119-2123

[18]王存琴,陈颖,汪雷,崔巧玉,段名扬,陈国军. HPLC同时测定大叶冬青叶中10种多酚成分的含量及抗氧化活性研究[J].天然产物研究与开发,2019, 31(4):557-565

基金资助:吉林省2022年省预算内基本建设资金(2022C041-6);

文章来源:田齐聪,于敏,刘守国,等.多维度定性定量评价电子束辐照灭菌对黄芪质量的影响[J].核农学报,2025,39(01):77-88.