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续苓健骨方调节骨组织m6A甲基化机制研究
摘要：目的 利用表观转录组学微阵列芯片技术检测续苓健骨方对绝经后骨质疏松症模型大鼠中骨组织mRNA的m6A甲基化修饰和基因表达的变化。方法 雌性SPF大鼠随机分为模型组、续苓健骨方组，采用去卵巢法构建绝经后骨质疏松症模型。治疗组以续苓健骨方药液进行灌胃给药，模型组给予等量生理盐水，运用MeRIP-qPCR和表观转录组学微阵列芯片技术，检测2组大鼠骨组织中mRNA的m6A甲基化和表达水平变化，并对这些mRNA进行GO和KEGG分析，基于检测结果选取6个差异甲基化基因进行验证。结果 与对照组相比，续苓组中差异表达的mRNA共有4 479个，其中2 298个上调，1 497个下调；1 215个基因m6A甲基化修饰水平显著变化，其中592个高甲基化，623个低甲基化；联合分析发现，825个基因同时发生mRNA表达和m6A修饰变化，433个m6A高甲基化且mRNA表达上调，392个m6A低甲基化且mRNA表达下调；GO和KEGG分析显示，m6A高甲基化且表达上调的基因参与骨髓细胞分化、线粒体中释放细胞色素C、红细胞分化等过程；m6A低甲基化且表达下调的基因参与甘油三酯分解代谢过程的调节、PPAR、磷脂酰肌醇、甲状腺激素、胆固醇代谢等信号通路；MeRIP-qPCR验证显示续苓组中Ggt1、Hps4、H1fx、Selp、Hras的相对m6A甲基化水平高于对照组。结论 续苓健骨方对绝经后骨质疏松模型大鼠骨组织中m6A甲基化修饰影响显著，其中Ggt1、Hps4、H1fx、Selp、Hras等基因的m6A甲基化修饰变化可能是其治疗绝经后骨质疏松症的机制之一。
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绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis, PMOP)主要表现为骨量减少，骨微结构退变，骨强度下降和骨脆性增加，易于发生骨折[1]。2018年骨质疏松症流行病学调查显示[2],骨质疏松症在中国50岁以上人群患病率为19.2%,其中女性患病率高达32.1%,严重影响我国中老年女性的身心健康，防治PMOP尤为重要。最新研究表明聚焦RNA修饰的表观转录组学在PMOP的发生和发展中起关键调控作用[3],N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenine, m6A)甲基化是真核生物中最常见的RNA化学修饰类型[4],m6A修饰在骨骼发育和代谢中起重要作用[5]。
续苓健骨方是课题组治疗PMOP的经验方，已获得国家发明专利(专利号：ZL201510784227.4),临床疗效明确[6],前期课题组已从骨代谢细胞分化增殖、调节血液钙磷代谢、改善骨密度等多个层面深入研究其作用的部分机制[7-9]。本研究利用PMOP大鼠模型进行体内实验，从甲基化修饰和基因表达角度探讨续苓健骨方治疗PMOP是否通过影响骨组织中m6A表观遗传修饰从而影响相关基因表达。利用甲基化RNA免疫共沉淀技术(methylated RNA immunoprecipitation, MeRIP)联合逆转录实时定量PCR(qPCR)和表观转录组学微阵列芯片技术，针对PMOP大鼠骨组织，检测两组间差异m6A甲基化修饰基因与两组间mRNA差异基因的表达，基于芯片检测结果对实验数据进行联合分析，为中药治疗PMOP提供理论依据。
1、材料与方法
1.1 实验药物
骨碎补、白术、赤芍、红花和甘草等12味中药组成续苓健骨方，总量122 g, 药物来源于福建省中医药科学院门诊部。
1.2 实验动物
健康雌性SPF级Sprague-Dawley(SD)大鼠6只，3月龄，体质量(270±30) g, 由杭州医学院提供，生产许可证编号：SCXK(浙)2019-0002,合格证编号：20220216Aazz0100000524,饲养于福建省中医药科学院比较医学中心。本实验已获得福建省中医药科学院实验动物管理委员会批准(批准编号：FJATCM-IAEC2022033)。
1.3 大鼠OP模型建立及分组
将6只大鼠随机分为两组：模型组和续苓健骨方组(续苓组),每组3只。适应性喂养7 d后，禁食8 h, 以2%戊巴比妥钠麻醉(0.2 mL/100 g),摘除双侧卵巢，建立OP模型并注射青霉素抗感染。造模1个月后开始灌胃给药，模型组给以等量生理盐水，持续喂养大鼠12周。
1.4 取材
12周后，大鼠给予水合氯醛麻醉后，取大鼠左右两侧股骨，去掉两端软骨，1 mL无菌PBS冲洗骨髓，1 500 r/min离心5 min, 去上清，液氮保存。
1.5 RNA的提取、质控及m6A免疫共沉淀、芯片检测
大鼠骨组织研磨后提取总RNA,NanoDrop ND测定纯度和含量，琼脂糖凝胶电泳检测完整性和gDNA污染。将RNA片段化后分为两部分，一部分作为Input, 另一部分用特异性m6A抗体进行免疫共沉淀处理，形成免疫复合物。磁珠洗脱含m6A修饰的RNA片段为“IP”样本，上清液回收未修饰的RNA为“Sup”。扩增cRNA并用Cy5和Cy3标记，与大鼠mRNA表观转录组学阵列杂交17 h, 用安捷伦扫描仪扫描载玻片。
1.6 MeRIP-qPCR质控及验证
为确保实验结果可靠性和准确性，本研究将RNA逆转录为cDNA后，进行实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测。针对6个大鼠骨组织样品，设计了阳性对照引物以及阴性对照引物，用来评估m6A甲基化水平的变化。在qPCR检测阶段，若阳性对照组%(MeRIP/Input)值至少是阴性对照组的2倍，则判断IP富集实验成功，MeRIP质量合格。选取6个差异m6A修饰基因进行验证，引物序列见表1。
表1验证基因PCR使用引物列表
1.7 数据处理分析
采用安捷伦软件(版本11.0.1.1)对G2505C双色通道中扫描获得的阵列图像进行分析。将IP(Cy5标记)和Sup(Cy3标记)的原始信号值与log2规模的Spike-in RNA强度平均值进行标准化处理。至少有3个样品保留QC标记的探针信号，以进行“m6A量”分析。计算m6A甲基化量，并筛选差异m6A甲基化修饰基因和差异表达基因，标准为差异表达倍数量(Foldchange≥1.5)和统计学显著性(P<0.05)。采用分级聚类展示两组间m6A甲基化修饰水平差异基因，火山图可视化差异mRNA的表达水平，使用标准的富集计算方法进行GO分析和Pathway分析。
2、结果
2.1 表观转录组学微阵列芯片实验流程的质量控制
本研究使用NanoDropND分光光度计对两组大鼠RNA进行定量及质量检测，采用OD260/280比值和OD260/230比值进行初步质控判断，比值在1.8～2.1(图1),表明RNA样本质量良好。MeRIP-qPCR质量检测结果如图2,阴性对照组%(MeRIP/Input)小于2,阳性对照组%(MeRIP/Input)大于90,MeRIP质量合格。对m6A修饰的mRNA进行层次聚类热图分析，6个样本自动分为两组，测序结果可信(图3)。
图1模型组和续苓组大鼠骨组织样本中RNA质控结果
图2MeRIP-qPCR质量检测
图3聚类分析图显示明显改变的m6A修饰的mRNA
2.2 mRNA m6A修饰水平与mRNA表达水平分析
两组大鼠骨组织基因芯片mRNA差异分析发现，续苓组与模型组相比，有4 479个mRNA差异表达，包括2 982个上调和1 497个下调，前10位差异表达基因信息见表2。筛选续苓组和模型组间m6A修饰水平差异的mRNA,发现续苓组同模型组相比，1 215个mRNA发生m6A甲基化差异修饰，其中升高592个，降低623个(图4),前10位m6A差异化修饰的基因具体信息见表3。
表2前10位mRNA差异表达的基因信息
表3前10位m6A甲基化差异修饰的基因信息
图4差异m6A甲基化修饰基因分布
2.3 大鼠骨组织中mRNA差异m6A修饰基因与差异表达基因的联合分析
将两组大鼠骨组织中差异m6A修饰基因与差异表达基因进行联合分析，结果以四象限图表示(图5)。共有825个基因同时发生差异表达和m6A甲基化修饰，m6A高甲基化且mRNA表达上调的基因有433个；m6A低甲基化且mRNA表达下调的基因有392个；无m6A高甲基化且mRNA表达下调的基因和m6A低甲基化且mRNA表达上调的基因。前10位具体基因信息见表4。
图5mRNA 差异m6A修饰基因与差异表达基因的联合分析
2.4 差异m6A修饰mRNA的GO富集分析和KEGG通路分析
为进一步揭示m6A差异甲基化基因和差异表达基因所参与的生物功能以及通路，进行了m6A修饰mRNA的GO分析和相关的pathway分析。
2.4.1 差异m6A甲基化修饰mRNA的GO富集分析结果：
如表5所示，m6A高甲基化且表达上调的 [LL]mRNA参与了骨髓细胞分化、线粒体中释放细胞色素C、红细胞分化等过程；m6A低甲基化且表达下调的mRNA参与了甘油三酯分解代谢过程的调节、脂肪酶活性调节、脂质定位等过程。
2.4.2 差异m6A甲基化修饰mRNA的KEGG通路分析结果：
m6A甲基化差异基因KEGG富集分析结果显示，m6A高甲基化且表达上调的基因未富集到信号通路，m6A低甲基化且表达下调的基因富集主要参与PPAR信号通路、磷脂酰肌醇信号传导系统、甲状腺激素信号通路、胆固醇代谢通路等4条通路，见表6。
2.5 MeRIP-qPCR验证候选m6A甲基化基因的表达水平
为验证所得数据的可靠性，本研究选择了6个甲基化修饰百分比升高且变化值排名靠前的基因(Ggt1、Selp、Hps4、Hras、H1fx、Fosl1)进行MeRIP-qPCR验证。结果如图6所示，续苓组样本中这些基因的m6A甲基化水平远高于对照组。6个候选差异基因中5个基因的验证结果与微阵列芯片数据相符，进一步证实了检测结果的可靠性。
表4前10位差异显著的m6A修饰且差异表达的基因信息
表5 m6A修饰mRNA的GO富集分析
表6KEGG分析显著性富集通路
图6MeRIP-qPCR验证候选m6A甲基化基因的表达水平(n=3)
3、讨论
绝经后骨质疏松症的实质原因是绝经后女性卵巢衰退，雌激素分泌下降所致的骨形成水平低下与骨吸收过度，两者之间的不平衡状态导致了骨代谢的失衡[10]。近年来研究发现，甲基化对骨稳态有重要影响，可通过调节RNA的剪切、翻译、降解等过程参与骨质疏松症的发展[11]。m6A甲基化可通过核因子κB、MAPK、PI3K/Akt等信号通路调控骨代谢相关基因表达，影响骨髓间充质干细胞、成骨细胞、破骨细胞活性及分化，从而防治骨质疏松症[12]。
研究表明补肾中药能够促进BMSCs成骨分化[13]。推测调控m6A甲基化修饰可能中药是治疗绝经后骨质疏松症的新机制，但仍需进一步研究和临床验证。前期课题组已研究证实续苓健骨方能够显著改善PMOP临床症状，且疗效优于阳性药物骨化三醇；能显著提高PMOP大鼠的骨密度；已建立续苓健骨方治疗PMOP大鼠的mRNA表达谱。其含药血清能促进成骨细胞MC3T3-E1的增殖；调控PMOP大鼠血钙磷代谢；续苓健骨方与阿仑膦酸钠协同作用，可能通过激活EphB4/EphrinB2信号通路改善PMOP大鼠骨组织和血清骨代谢指标；能上调PMOP大鼠股骨远端骨组织HIF-1α/VEGF表达，促进血管生成及骨形成，稳定骨代谢，减少去卵巢大鼠骨丢失。综上，续苓健骨方部分机制已证实，但其是否通过调控m6A修饰影响骨代谢的相关基因和信号通路来治疗绝经后骨质疏松症大鼠尚待研究。
本研究对续苓组大鼠和对照组大鼠的骨组织mRNA进行检测和筛选，结果显示，续苓组骨组织中有1 215个差异m6A甲基化修饰的基因，其中高甲基化基因592个，低甲基化基因623个；同时，有433个高甲基化且表达上调的基因，392个低甲基化且表达下调的基因。基于检测结果，筛选出Ggt1、Hps4、H1fx、Selp、Hras 这5个m6A甲基化水平升高同时表达上调的基因。
Ggt1是一种蛋白质编码基因，研究表明Ggt1可能是Zfp687调节的破骨细胞生成的基因[14]。研究发现，Hps4的敲低可抑制肝癌细胞增殖并诱导细胞凋亡[15];H1fx优先在未成熟的胚胎细胞中表达，并在具有神经特性的细胞中发挥一些作用[16]。Ggt1、Hps4、H1fx暂未发现同绝经后骨质疏松症的相关报道。研究表明低骨密度与Selp的异常表达密切相关[17];钠/肌醇协同转运蛋白1(SMIT1)和肌醇(MI)对于成骨和骨形成至关重要，而Selp是SMIT1和MI的新靶基因[18]。有研究表明，Hras是一种新的骨稳态调节剂，Hras G12V突变可导致破骨细胞生成增加，导致Costello综合征中的骨丢失[19]。四物汤治疗骨质疏松症可以通过Hras发挥作用，主要通路包括PI3K/Akt、MAPK等信号通路[20]。研究证实[21],MAPK信号通路对于体内骨形成至关重要，参与成骨细胞和破骨细胞[22]的分化过程，影响绝经后骨质疏松症的发展。由此推测，续苓健骨方可能通过调控Hras的m6A甲基化水平参与PI3K/Akt、MAPK信号通路从而治疗PMOP大鼠。
综上所述，本研究运用MeRIP-qPCR和表观转录组学微阵列芯片技术，得到续苓健骨方治疗PMOP模型大鼠关系密切的基因功能和通路信息，证实续苓健骨方对PMOP模型大鼠中骨组织m6A甲基化修饰变化影响显著，推测Ggt1、Hps4、H1fx、Selp、Hras等基因可能是续苓健骨方治疗绝经后骨质疏松症的相关基因，续苓健骨方可能通过Hras参与PI3K/Akt、MAPK信号通路的调控从而治疗PMOP大鼠。后续需要先筛选出调控这些靶基因的甲基化酶，通过细胞实验验证甲基化酶与这些靶基因的调控关系，并深入研究续苓健骨方如何通过甲基化酶调控靶基因表达以治疗PMOP。
参考文献:
[1]中华医学会骨质疏松和骨矿盐疾病分会,章振林.原发性骨质疏松症诊疗指南(2022)[J].中国全科医学,2023,26(14):1671-1691.
[2]中华医学会骨质疏松和骨矿盐疾病分会.中国骨质疏松症流行病学调查及“健康骨骼”专项行动结果发布[J].中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志,2019,12(4):317-318.
[6]谢丽华,柴昊,叶云金,等.续苓健骨颗粒治疗肾虚血瘀型绝经后骨质疏松症的疗效及转录机制研究[J].中国骨质疏松杂志,2022,28(4):558-561.
[7]陈娟,陈赛楠,叶云金,等.续苓健骨汤含药血清对MC3T3-E1细胞分化及增殖的影响[J].中国骨质疏松杂志,2019,25(11):1545-1549.
[8]陈赛楠,吴华嵩,程佑民,等.续苓健骨方对去卵巢骨质疏松模型大鼠血液钙磷代谢的影响[J].中国骨质疏松杂志,2019,25(4):528-532.
[9]葛继荣,李生强,陈娟,等.续苓健骨方对骨质疏松模型大鼠骨密度及OPG和RANKL蛋白表达的影响[J].中国骨质疏松杂志,2016,22(5):592-595.
[12]陈相汕,刘桦,孙伟康,等.m6A甲基化调控骨代谢防治骨质疏松症的作用机制[J].中国组织工程研究,2024,28(28):4572-4577.
[13]李沂霖,王花欣,田硕,等.补肾中药调控骨髓间充质干细胞成骨分化的RNA m6A修饰作用研究[J].世界中医药,2024,19(2):261-266.
基金资助:国家自然科学基金项目(82374483);福建省科技厅省属公益类科研院所基本科研专项(2022R1003002,2023R1003004);国家中医药管理局高水平中医药重点学科建设项目(中医骨伤科学)(zyyzdxk-2023106);福建中医药大学中医骨伤科学学科开放课题资助(XGS2023001);
文章来源:屈丽,谢丽华,叶云金,等.续苓健骨方调节骨组织m6A甲基化机制研究[J].中国骨质疏松杂志,2025,31(01):1-7+43.
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中药饮片的颜色一直是中药饮片性状鉴别的重要质控指标｡中药饮片通过色差仪测定出饮片的颜色与亮度,利用计算机处理后得到相应的色差值,从而得到客观量化的质控指标[4-6]｡然而,目前对枳壳麸炒品的颜色描述仅有“色较深,偶有焦斑”寥寥数字,且人为评判的经验描述主观性较强,导致长期以来麸炒枳壳质量存在差别｡
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药理研究表明,锁阳在抗衰老､免疫调节及抗炎等方面具有显著作用,广泛用于补肾壮阳､治疗便秘及与老龄化相关的慢性疾病[3-5]｡锁阳分布于我国西北地区,包括新疆维吾尔自治区､内蒙古自治区､甘肃省和宁夏回族自治区等省份,是传统中药材产业的重要组成部分,同时是当地经济发展的特色资源[6]｡
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2025-08-22
黄芩为唇形科植物ScutellariabaicalensisGeorgi根,其提取物具有抗炎,抗病毒､抗肿瘤､抗氧化､抗菌等多种生物学功能,广泛应用于呼吸道感染､肺癌､结肠炎､肝炎及过敏性疾病的治疗[1]｡近年来,黄芩的活性成分引起了越来越多的关注,尤其是其抗肿瘤和免疫调节功能相关研究增多｡
2025-08-12
雌性红莱菔是采用获得国家发明二等奖的“中国秋冬萝卜核-胞质雄性不育系的选育及应用”这一世界领先的遗传学育种技术培育出来的萝卜新品种雌性红萝卜[1]经过炮制后的一味药食同源中药材｡在食疗应用的过程中,发现雌性红莱菔具有预防感冒及改善肿瘤晚期患者临床症状等作用[2]｡
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导尿管相关尿路感染(catheter-associatedurinarytractinfection,CAUTI)在老年住院患者中发病率高､复发频繁,是临床亟待解决的难题[1-2]｡当前抗生素治疗虽能控制病原体增殖,但面临两大局限:一是耐药性问题日益突出,二是难以促进受损尿道黏膜的功能修复[3]｡
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太子参为石竹科多年生草本植物孩儿参[Pseudostellariaheterophylla(Miq.)PaxexPaxetHoffm.]的块根[1],为2020版《中国药典》所收载的常用中药,广泛用于多类方剂,是生产中成药重要的原料｡该药具有益气健脾,生津润肺等功效,现代医学研究[2-3]发现,太子参还具有增强免疫､抗疲劳､改善记忆等多种药理作用｡
2025-07-21
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2025-07-11
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2025-07-10
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