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槲皮素抗焦亡抑制LPS诱导HUVEC炎症的作用机制

2025-01-09 189 上传者：管理员

摘要：目的研究槲皮素抑制焦亡抑制脂多糖(LPS)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)炎症的作用机制。方法在HUVEC中加入培养基设为Control组，加入1 ng/ml LPS为LPS组，LPS组加入10μg/ml槲皮素为LD组、20μg/ml槲皮素为MD组、50μg/ml槲皮素为HD组。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组炎症因子，实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测HUVEC中炎症因子及焦亡相关基因表达，Western印迹检测HUVEC中焦亡相关蛋白及磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)蛋白表达，研究槲皮素抗焦亡抑制LPS诱导HUVEC炎症的作用。结果与其他组相比，LPS组HUVEC上清液中炎症因子上调，白细胞介素(IL)-1β、IL-12、IL-18、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、NLR家族Pyrin域蛋白(NLRP)3 mRNA表达上调，NLRP3、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-1、消皮素(GSDM)D、IL-1β蛋白表达及乳酸脱氢酶(LDH)水平升高，差异显著(P<0.05)。应用槲皮素干预后，LPS诱导HUVEC炎症程度减轻，IL-1β、IL-12、IL-18、IL-6、TNF-α mRNA表达较LPS组下调，NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β蛋白表达及LDH水平较LPS组下调，并呈现浓度依赖性，差异显著(P<0.05)。LPS诱导HUVEC炎症模型，应用槲皮素干预后检测PI3K、AKT、核因子(NF)-κB蛋白，提示槲皮素下调PI3K/AKT/NF-κB通路激活。结论槲皮素通过PI3K/AKT/NF-κB/NLRP3/Caspase-1/GSDMD/IL-1β通路抑制焦亡抑制LPS诱导HUVEC炎症。

关键词：
人脐静脉内皮细胞(HUVEC)
槲皮素
消皮素(GSDM)D
炎症因子
磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)
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动脉粥样硬化是目前临床亟待解决的问题[1],内皮细胞是动脉粥样硬化病理反应的始动细胞，内皮细胞的炎症是动脉粥样硬化发生的第一步病理反应[2],进一步分泌炎症因子，募集炎症细胞导致动脉粥样硬化进展。因晚期的动脉粥样硬化出现并发症时无特效药，因此早期干预是适宜的干预时间点。中药可多靶点抗动脉粥样硬化，已经引起研究者重视，既往研究发现，槲皮素可以通过抗氧化应激抑制动脉粥样硬化[3],本实验探讨槲皮素调控焦亡抑制脂多糖(LPS)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)炎症的作用机制。

1、材料与方法

1.1 实验仪器及材料

CO2恒温细胞培养箱(美国Thermo Fisher公司),超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司),聚合酶链反应(PCR)扩增仪(美国Applied Biosystems公司),水平电泳仪(美国Bio-Rad公司),高灵敏度化学发光成像分析系统(美国Thermo Fisher公司)。胎牛血清(以色列Biological Industries公司),青霉素、链霉素、RPMI1640培养基、CCK-8、LPS(上海碧云天生物技术有限公司),槲皮素(美国 MedChemExpress公司),PCR引物(上海生工生物工程有限公司),PCR反转录及荧光定量试剂盒(日本TaKaRa公司)。

1.2 细胞活力测定及分组

将细胞接种在96孔板中，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞3次。将10 μl CCK-8工作溶液加入每个孔中并在37 ℃下孵育2 h。使用分光光度计在450 nm处测量吸光度。细胞活力计算公式为：细胞活力(%)=(As-Ab)/(Ac-Ab)×100%,其中As样品的吸光度，Ab空白的吸光度和Ac阴性对照的吸光度。HUVEC中加入培养基的为Control组，加入1 ng/ml LPS为LPS组，LPS组加入10 μg/ml槲皮素为LD组、20 μg/ml槲皮素为MD组、50 μg/ml槲皮素为HD组。

1.3 检测HUVEC培养基中白细胞介素(IL)-1β、IL-18炎症因子水平

样品吸每孔100 μl加入酶标反应孔中，设1个复孔，置于37 ℃,40～60 min。用洗涤液满孔洗涤3次，3 min/次。根据酶结合物提供商提供的参考工作稀释度进行37 ℃,30～60 min之间，短于30 min往往结果不稳定，每孔加100 μl洗涤。首选过氧化氢尿素溶液，每孔100 μl, 置37 ℃避光放置3～5 min, 加入终止液显色，每孔加入终止液50 μl终止反应，于20 min内测定实验结果，邻苯二胺(OPD)显色后采用492 nm波长检测。

1.4 乳酸脱氢酶(LDH)测定

将HUVEC培养到96孔板中，并用1 ng/ml LPS处理24 h, 有或没有50 μmol/L槲皮素预处理1 h。通过在执行测定前45 min加入20 μl 10×裂解溶液来创建最大LDH释放对照。将120 μl培养上清液转移到新的96孔板中，并向每个孔中加入60 μl工作溶液，在室温下在黑暗中孵育25 min, 然后读取490 nm处的吸光度。

1.5 实时荧光定量(qRT)-PCR

使用RNA isoTMPlus试剂从组织中提取总RNA,并使用分光光度计进行定量。定量后，将4 μg mRNA逆转录为cDNA。qRT-PCR测定使用ABI PRISM7500实时PCR系统进行。使用SYBR Prime Script RT-PCRTM试剂盒试剂进行PCR扩增。PCR条件为40个循环，在95 ℃变性5 s, 在60 ℃退火和延伸30 s。目标mRNA水平标准化为β-肌动蛋白(actin)。引物序列(5′-3′):β-actin 正向：GCTCTCTTCCAGCCTTCCTT,反向：GGTCTTTACGGATGTCAACG;NLR家族Pyrin域蛋白(NLRP)3正向：CTCGCATTGGTTCTGAGCTCA,反向：AGTAAGGCCGGAATTCACCA;IL-1β 正向：TCCAGGATGAGGACATGAGCAC,反向：GAACGTCAC-ACACCAGCAGGTTA;IL-12 正向：AGTTTGGCCA-GGGTCATTCC,反向：TCTCTGGCCGTCTTCACCAT;IL-6 正向：CCACTTCACAAGTCGGAGGCTTA,反向：GCAAGTGCATCATCGTTGTTCATAC;肿瘤坏死因子(TNF)-α正向：GTTCTATGGCCCAGACCCTCAC,反向：GGCACCACTAGTTGGTTGTCTTTG;IL-18正向：ACCGAATTCACTGTACAACCGCAGTAATAC,反向：GCCTCTAGAAACATTACAGATTCC。

1.6 Western印迹检测Caspase-1、NLRP3、IL-1β、消皮素(GSDM)D、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、核因子(NF)-κB p65及磷酸化、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)蛋白表达

样品制备及凝胶电泳：在蛋白样品上样，均匀混合样品，将预染Maker和变性后蛋白样品分别加入凝胶的点样孔中，电泳，至嗅酚蓝跑至凝胶底部，结束电泳。转膜、封闭、抗体孵育：将聚偏氟乙烯(PVDF)膜5%牛血清白蛋白(BSA)孵育20 min, 封闭膜。加入一抗，过夜后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗兔二抗(1∶2 000稀释),室温摇床孵育1 h, 使HRP标记的二抗与一抗充分结合。PBST漂洗4次，5 min/次，洗去未结合的二抗。ECL法拍照。

1.7 统计学分析

采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2、结果

2.1 CCK-8检测细胞活力

0、10、20、50、75、100 μg/ml不同浓度的槲皮素孵育HUVEC 1 h后，应用LPS刺激24 h, 将细胞与CCK-8一起孵育以评估细胞毒性；结果显示，与0 μg/ml组[(62±3)%]相比，10、20、50 μg/ml槲皮素组细胞存活率[(70±3)%、(75±4)%、(83±3)%]明显升高，且呈明显浓度依赖性(P<0.05)。75 μg/ml槲皮素组细胞存活率[(85±5)%]与50 μg/ml无显著差异(P>0.05),而100 μg/ml组槲皮素细胞存活率为[(75±4)%],故选择10、20、50 μg/ml作为后续实验浓度。

2.2 各组细胞培养基中LDH水平

与Control组比较，LPS组及各槲皮素浓度组LDH明显升高(P<0.05);LD、MD、HD组LDH水平较LPS组明显下降，并呈明显浓度依赖性(P<0.05)。见表1。

2.3 各组细胞培养基中IL-1β、IL-18水平

与Control组比较，LPS干预后，IL-1β、IL-18水平明显增加(P<0.05);应用槲皮素干预后，与LPS组比较IL-1β、IL-18释放明显减少，并呈明显浓度依赖性(P<0.05)。见表1。

表1 各组细胞培养基中 LDH、IL-1β、IL-18 水平比较

2.4 qRT-PCR检测IL-1β、IL-12、IL-18、IL-6、TNF-α、NLRP3

mRNA表达 LPS组IL-1β、IL-12、IL-18、IL-6、TNF-α、NLRP3 mRNA表达明显高于Control组及各浓度槲皮素组(P<0.05);LD组、MD组、HD组IL-1β、IL-12、IL-18、IL-6、TNF-α、NLRP3 mRNA表达较LPS组依次明显下调，且呈明显浓度依赖性(P<0.05)。见表2。

表2 各组细胞培养基中NLRP3、IL-18、IL-12、IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA比较

2.5 Western印迹检测各组中焦亡相关蛋白表达

与Control组比较，LPS组除AKT蛋白表达外，其余焦亡相关蛋白明显上调(P<0.05);与LPS组比较，各槲皮素浓度组除AKT蛋白表达外，其余焦亡蛋白明显下调，并呈明显浓度依赖性(P<0.05)。HD组P-PI3K、P-AKT、N-GSDMD、ASC、caspase-1、IL-1β蛋白表达与Control组无明显差异(P>0.05)。见表3、图2。

表3 各组细胞焦亡相关蛋白表达

图2 各组焦亡相关蛋白表达

3、讨论

动脉粥样硬化是一种心血管动脉血管壁慢性炎症，是冠心病、心肌梗死、脑梗死、脑出血等常见心脑血管疾病的主要原因[4]。血管内皮细胞激活是动脉粥样硬化的始动因素[5],目前临床上尚无有效控制动脉粥样硬化晚期合并疾病的药物，因此，筛选早期控制动脉粥样硬化药物成为研究热点。

中药因其多靶点调控的特性在动脉粥样硬化的防治中起到了独特作用，槲皮素也被称为栎精或槲皮黄素，是一种具有多种生物活性的黄酮类化合物。许多膳食植物(水果、蔬菜、谷物等)中都含有槲皮素，其中荞麦、西红柿、洋葱中含量较高。许多中草药如罗布麻、槐米、侧柏叶、高良姜、款冬花、桑寄生、三七、银杏等也含有槲皮素。研究发现，槲皮素预防心血管疾病的机制与其抗炎、抗氧化作用密切相关[6]。研究证实，经常食用富含黄酮的食物可以降低患冠心病的风险[7]。

通过体外细胞实验及体内动物实验研究证实了槲皮素的心脏保护作用，同时阐明了一些相关机制，槲皮素作用于巨噬细胞可以减少炎症相关基因的表达，如TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β、Y干扰素诱导蛋白-10及环氧合酶(COX)-2[8,9]。在人原代脂肪细胞，槲皮素降低TNF-α诱导的炎症基因表达，IL-6、IL-8、膜辅蛋白(MCP)-1分泌及NF-κB转录活化[6]。槲皮素可抵抗H2O2刺激人血管内皮细胞诱发的脂质过氧化反应；还可减少H2O2刺激人肝细胞诱发的NF-κB转录活化[10]。

细胞焦亡是发生在炎性小体激活下游的细胞程序性死亡[11,12],研究发现，动脉粥样硬化病变组织中焦亡相关蛋白明显上调[13～15],因此研究动脉粥样硬化中焦亡的调控对于防治动脉粥样硬化具有重要意义。本研究发现，槲皮素与PI3K抑制剂Ly294002有类似结构，大多数PI3K抑制剂为ATP竞争性抑制剂。PI3K各亚型之间的ATP结合位点几乎相同，提示槲皮素可能也有PI3K抑制剂作用，本实验结果提示，槲皮素抑制LPS导致的HUVEC细胞中PI3K磷酸化，呈浓度依赖性；进一步下调AKT磷酸化，减少NF-κB P65磷酸化后核转位，抑制焦亡相关蛋白表达，减少IL-1释放，抑制LPS激活HUVEC细胞中炎症反应。提示槲皮素可以通抑制PI3K/AKT激活，抗焦亡抑制LPS诱导HUVEC炎症[16～21]。

参考文献:

1《中国脑卒中防止报告2019》编写组.《中国脑卒中防治报告2019》概要[J].中国脑血管病杂志,2020;17(5):272-81.

2中国高血压防治指南修订委员会,高血压联盟(中国),中国医疗保健国际交流促进会高血压病学分会等.中国高血压防治指南(2024年修订版)[J].中华高血压杂志(中英文),2024;32(7):603-700.

3北京高血压防治协会,北京糖尿病防治协会,北京慢性病防治与健康教育研究会等.基层心血管病综合管理实践指南2020[J].中国医学前沿杂志(电子版),2020;12(8):1-73.

4刘莉华,宛晓春,李大祥.黄酮类化合物抗氧化活性构效关系的研究进展(综述)[J].安徽农业大学学报,2002;(3):265-70.

9郭双,邢栋,吕勃.细胞凋亡及细胞程序性坏死和细胞焦亡的研究进展[J].中华实用诊断与治疗杂志,2021;35(3):321-4.

10赵战芝,姜志胜.我国动脉粥样硬化基础研究几个热点领域的新进展[J].中国动脉硬化杂志,2019;27(8):645-54.

文章来源:汪晶,刘卓,唐玉立,等.槲皮素抗焦亡抑制LPS诱导HUVEC炎症的作用机制[J].中国老年学杂志,2025,45(01):191-194.