狼毒始载于《神农本草经》，在我国具有悠久的药用历史，主逐水祛瘀、破积杀虫，可外用于淋巴结结核、皮癣、灭蛆等。《中国药典》2020年版和《内蒙古蒙药饮片炮制规范》（2020年版）都将大戟科植物狼毒大戟Euphorbia fischeriana Steud.的根部作为狼毒的正品药材[1-2]。狼毒大戟为多年生草本植物，主要分布于黑龙江、辽宁、内蒙古及河北等地，春、秋二季采收[3]。近年来，很多学者对狼毒大戟的化学成分进行研究，发现了一系列结构多样的二萜和杂萜类化合物，如巴豆烷、松香烷、海松烷等类型，表现出显著的抗肿瘤、抗炎等药理活性[4-8]。但目前的化学研究多集中在脂溶性成分，即二萜类化合物，但对于鞣酸类和糖苷类等水溶性化合物鲜有研究[9]，并不能完整阐释狼毒大戟的药效物质基础。

在前期研究中，本课题组首次从狼毒大戟乙醇提取物的醋酸乙酯萃取部位分离得到一系列的鞣酸类化合物，其对α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase）表现出显著的抑制作用，可作为潜在的降糖活性先导物[10]。为进一步阐明狼毒大戟的药效物质基础，开发利用其资源，为临床应用提供依据，本研究对狼毒大戟乙醇提取物的正丁醇萃取部位开展化学成分研究。通过多种色谱分离手段，共分离得到8个酚酸类化合物，分别鉴定为苯甲酸甲酯-4-O-α-L-呋喃阿拉伯糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖苷（methyl benzoate-4-O-α-L-arabinofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside,1）、苯乙基-6-O-α-L-呋喃阿拉伯糖基-β-D-葡萄糖苷（phenethyl 6-O-α-L-arabinofuranosyl-β-D-glucopyranoside,2）、东莨菪苷（scopoletin,3）、corilagin(4）、6-羟基-2-甲氧基苯乙酮-4-O-β-D-葡萄糖苷（6-hydroxy-2-methoxy acetophenone-4-O-β-D-glucopyranoside,5）、6-羟基-2-甲氧基苯乙酮-4-O-α-L-阿拉伯糖-(1→6)-β-D-葡萄糖苷（6-hydroxy-2-methoxyacetophenone-4-O-α-L-arabinofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside,6）、6-羟基-2-甲氧基苯乙酮-4-O-β-D-木糖-(1→6)-β-D-葡萄糖苷（6-hydroxy-2-methoxyacetophenone-4-O-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside,7）、erythroxyloside B(8），结构见图1。其中，化合物1为新化合物，命名为狼毒酚苷A(euphfischcoside A），化合物2～4为首次在狼毒大戟中分离到。本研究筛选了所有化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性，化合物4和8表现出一定的抑制作用，其半数抑制浓度（median inhibition concentration,IC50）值分别为（7.44±3.95）μmol/L和（134.40±30.27）μmol/L。

图1 化合物1～8的结构

1、仪器与材料

AVANCE III-600/400型核磁共振仪（美国Bruker公司）；MCP 100型旋光仪（奥地利Anton Paar公司）、Jasco V-650型紫外光谱仪（日本JASCO公司）；VERTEX 70傅里叶变换红外光谱仪（美国Bruker公司）；Q Exactive组合型四极杆Orbitrap质谱仪（美国Thermo Scientific公司）；Waters 2695型高效液相色谱仪，配备2996型检测器（美国Waters公司）；Agilent 1100半制备型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；YMC-Pack ODS-A半制备型色谱柱（250 mm×10 mm,5μm，日本YMC公司）；LGJ-10真空冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司）；低温冷却液循环泵（DLK-2010，宁波新芝生物科技股份有限公司）；EYELA N-1300型旋转蒸发仪（日本东京理化株式会社）；Spectra Max i3x酶标仪（美国Molecular Devices公司）。

HP-20大孔吸附树脂（沧州茂全新材料科技有限公司）；Sephadex LH-20型凝胶（瑞士Pharmacia公司）；ODS填料（30～50μm，日本YMC公司）；对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-NPG）、α-葡萄糖苷酶、阿卡波糖（Acarbose）（上海源叶生物科技有限公司）；碳酸钠（北京百灵威科技有限公司）；PBS缓冲液（美国Hy Clone公司）。

狼毒大戟于2023年8月采自黑龙江省林甸县，经中日友好医院马秉智副主任药师鉴定为大戟科大戟属狼毒大戟E.fischeriana Steud.的根部，该标本（ID-ZYPZ-202308-EF）现存放于北京中医药大学中药学院中药炮制系。

2、方法

2.1提取与分离

将8.0 kg干燥的狼毒大戟根部粉碎，以10倍量90%乙醇冷浸过夜，重复3次，合并提取液，回收溶剂得1.1 kg粗提物。用20 L纯水将其分散，依次用25 L的石油醚、二氯甲烷、醋酸乙酯和正丁醇萃取3～5次，回收溶剂，得正丁醇部位118.0 g。取正丁醇部位（115.0 g），纯水溶解，进行HP-20大孔吸附树脂柱色谱，依次用纯水、25%、55%及95%乙醇洗脱，每个梯度洗脱3个柱体积，回收溶剂，得55%乙醇-水洗脱部位（LDBu-55E,15.8 g）和25%乙醇-水洗脱部分（LDBu-25E,33.98 g）。

取LDBu-55E样品（15.5 g）加水溶解，通过Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱色谱分离，纯水洗脱，经HPLC分析，合并得子流分Fra.55E-A～E。其中，流分55E-A经半制备型高效液相色谱仪纯化（甲醇-0.1%乙酸水35∶65），得化合物5(9 mg,tR=14 min）；流分55E-B经半制备型高效液相色谱仪纯化（甲醇-0.1%乙酸水30∶70）得化合物6(10 mg,tR=10 min）和7(6 mg,tR=11 min）。

取LDBu-25E样品（33.0 g）经ODS中压柱色谱分离，洗脱体系为甲醇和水（2∶98～50∶50），经HPLC分析合并，得子流分Fra.25E-A～H。流分Fra.25E-C经Sephadex LH-20柱色谱分离，纯水洗脱，次流分C-27～32经半制备型高效液相色谱仪纯化（甲醇-0.1%乙酸水22∶78），得化合物1(5.5mg,tR=25 min）和3(28 mg,tR=18 min）；流分Fra.25E-D，经Sephadex LH-20柱色谱分离，甲醇洗脱，次流分D-2经半制备型高效液相色谱仪纯化（甲醇-0.1%乙酸水23∶77），得化合物4(7.5 mg,tR=23 min）；流分Fra.25E-E经Sephadex LH-20柱色谱分离，纯水洗脱，次流分E-21～30经半制备型高效液相色谱仪纯化（甲醇-0.1%乙酸水35∶65），得化合物2(12 mg,tR=16 min）；流分Fra.25E-F经Sephadex LH-20柱色谱分离，纯水洗脱，次流分F-21～24经半制备型高效液相色谱仪纯化（甲醇-0.1%乙酸水40∶60，得化合物8(16 mg,tR=15 min）。

2.2糖的绝对构型确定

称取2.0 mg化合物1，加入5.0 m L稀HCl溶液（2 mol/L），氮气保护，60℃砂浴反应8 h，回收溶剂。浓缩物加水混悬，加入等体积的醋酸乙酯萃取3次，取水层，回收溶剂，冻干，得化合物1的糖部分。

根据文献报道[11-12]，取2.0 mg的单糖标准品（D-Glc、L-Glc、L-Ara、D-Ara）及化合物1的糖部分，分别加入4.0 mg L-半胱氨酸甲酯（L-cysteine methyl ester）和2.0 m L的无水吡啶，60℃砂浴反应1 h，加入5.0μL邻甲苯异硫氰酸酯（o-tolyl isothiocyanate），继续反应1 h。反应结束，利用HPLC分别检测以上反应液。

HPLC分析条件：色谱柱Avantor®Apollo C18(250 mm×4.6 mm,5μm），流动相为25%乙腈（0.1%甲酸），体积流量0.8 m L/min，柱温35℃，进样量10μL，检测波长250 nm，检测时间40 min。

3、结构鉴定

化合物1：白色无定型粉末。[α]D20-67°(c 0.2,Me OH)，易溶于甲醇。高分辨质谱（HR-ESI-MS）显示其准分子离子峰[M+Na]+m/z 469.131 0（计算值为469.131 7,C19H26O12Na+），可知分子式为C19H26O12。红外光谱（IR）显示该化合物具有羟基（3 366 cm-1）和羰基（1 677 cm-1）等基团。

从1H-NMR谱图(400 MHz,CD3OD)（表1）中可知，化合物1含有4个芳香氢信号（δH7.98,d,J=8.8 Hz,2H;7.16,d,J=9.2 Hz,2H),2个糖端基信号（δH4.99,d,J=7.6 Hz,1H;4.92,d,J=1.5 Hz,1H），及1个甲氧基信号（δH3.87,s,3H）。13C-NMR(100 MHz,CD3OD)谱图（表1）显示有26个碳信号，结合HSQC谱图可知化合物1有1个羰基碳(δC168.3),1个苯环（包括1个连氧碳δC162.8),2个糖基(δC110.1～63.1)及1个甲氧基(δC52.4)。在HMBC谱中（图2),H-6/H-2和C-7的相关信号，结合甲氧基氢(δH3.87)和C-7的相关信号确定了对取代苯甲酸甲酯的基本骨架。

表1 化合物1的1H-NMR和13C-NMR数据(400/100 MHz,CD3OD)

图2 化合物1主要的HMBC、1H-1H COSY和NOESY相关

通过综合分析化合物1的糖基数据，可知化合物1应有1个葡萄糖(δC101.6,77.9,77.1,74.8,71.7,68.2)和1个阿拉伯糖(δC110.1,85.9,83.4,78.9,63.1)。在COSY谱中，H-1′(δH4.99)和H-2′(δH3.47)、H-3′(δH3.47)和H-4′(δH3.36)、H-4′(δH3.36)和H-5′(δH3.68)、H-5′(δH3.36)和H2-6′(δH4.08,3.61)的相关信号归属了1个葡萄糖基上质子信号；H-1′′(δH4.92)和H-2′′(δH4.00)、H-2′′(δH4.00)和H-3′′(δH3.82)、H-3′′(δH3.82)和H-4′′(δH3.96)、H-4′′(δH3.96)和H-5′′(δH3.72,3.62)的COSY相关信号，及H-1′′(δH4.92)和C-4′′(δC68.2)/C-3′′(δC78.9)的HMBC信号说明存在1个五元环糖，结合H-3′和H-5′的NOESY信号，及H-1′′(δH4.92)的偶合常数为1.5 Hz(<4 Hz），说明阿拉伯糖的相对构型为α（图2）。进一步将化合物1进行酸水解和衍生化，利用HPLC确定化合物1中D-Glc和L-Ara的存在（图3）。

图3 化合物1的糖基和单糖的衍生物HPLC分析图

在HMBC谱中，H-1′(δH4.99)和C-4 (δC162.8)的相关信号说明葡萄糖基连接在苷元的4位碳。而葡萄糖基的6位碳化学位移升高(δC68.2)，说明阿拉伯糖连接在葡萄糖的6位碳，H-1′′(δH4.92)和C-6′(δC68.2)的HMBC相关信号证明了这点（图2）。基于此，化合物1的结构被确定为苯甲酸甲酯-4-O-α-L-呋喃阿拉伯糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖苷。经Sci Finder网站检索，未发现相关报道，表明化合物1为新化合物，命名为狼毒酚苷A(euphfischcoside A），见图1。

4、α-葡萄糖苷酶抑制实验

采用α-葡萄糖苷酶的抑制实验评价分离化合物的降糖活性[10]。以p-NPG作为底物，阿卡波糖为阳性药，实验分为5组，即空白组、对照组、样品组、样品空白组和阳性对照组，每组设置3个复孔。首先，每组依次加入100μL PBS溶液至96孔板中，对照组、样品组和阳性对照组加入20μL α-葡糖苷酶（0.5 U/m L），空白组和样品空白组加入等量的PBS溶液。然后，样品组和样品空白组加入20μL样品溶液（200、100、50、25、12.5、6.25、3.125μmol/L），阳性对照组加入20μL阳性药阿卡波糖（10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5μmol/L），空白组和对照组加入等量的PBS溶液。37℃孵育15min后，每孔加入20μL(1.25 mg/m L）的p-NPG，继续37℃孵育15 min。最后，每孔加入40μL(0.2mol/L）的碳酸钠溶液终止反应，并利用酶标仪在405 nm处检测吸光度（A）值。

结果表明，化合物4和8对α-葡萄糖苷酶表现出一定的抑制活性，其IC50值分别为（7.44±3.95）μmol/L和（134.40±30.27）μmol/L，阳性药阿卡波糖的IC50值为（0.99±0.02）μmol/L。

5、结论

本研究从狼毒大戟乙醇提取物的正丁醇萃取部位分离并鉴定了8个酚酸类化合物，并评价了所有化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，进一步丰富了狼毒大戟水溶性药效物质基础。

按照结构母核，本研究到的8个酚酸类化合物可分为3类，包括3个小分子酚酸苷（化合物1～3）、1个鞣酸（化合物4）、4个间苯三酚苷（化合物5～8）。其中，化合物1为新化合物，化合物4表现出显著的α-葡萄糖苷酶抑制作用，IC50值为（7.44±3.95）μmol/L。同时，其他的小分子酚酸苷（1～3）或间苯三酚苷（5～8）对α-葡萄糖苷酶的抑制作用较弱。结合本课题组前期从狼毒大戟乙醇提取物的醋酸乙酯萃取部位发现的一系列α-葡萄糖苷酶抑制活性化合物[10]可知，没食子酸多取代的葡萄糖鞣酸化合物具有潜在的抑制α-葡萄糖苷酶活性，其多酚羟基和葡萄糖的母核或许更易与α-葡萄糖苷酶结合，从而发挥降糖活性。

参考文献:

[1]内蒙古蒙药饮片炮制规范[S]. 2020:359.

[2]中国药典[S].一部. 2020:298-299.

[3]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[第44(3)卷][M].北京:科学出版社, 1997:89.

[12]王团委,王振中,王秋红,等.华南忍冬花蕾中1个新的单萜苷类化合物[J].中草药, 2022, 53(23):7317-7323.

[13]杨丹,谢海辉.法兰地草莓的芳香类和黄酮类成分[J].热带亚热带植物学报, 2017, 25(6):617-624.

[14]范雨欣,徐瑞雯,张晓祎.中华枸杞中1个新的香豆素葡萄糖苷[J].中草药, 2024, 55(1):23-29.

基金资助:国家自然科学基金项目(82304872);国家自然科学基金项目(81872761);北京市自然科学基金青年项目(7234403);

文章来源:张佳,王梦雅,李周子祺,等.狼毒大戟中的酚酸化合物及α-葡萄糖苷酶抑制活性研究[J].中草药,2025,56(02):389-394.