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芫花素对丝裂原活化蛋白激酶p38α的抑制作用研究

2025-03-20 116 上传者：管理员

摘要：目的探讨芫花素对抗炎靶点丝裂原活化蛋白激酶p38α(p38α mitogen-activated protein kinase, p38αMAPK)的抑制性药理作用，从分子层面阐释其抗炎机制。方法应用AutoDock Vina软件将芫花素与靶酶p38α晶体结构1KV2的活性位点进行分子对接，探索两者的相互作用模式，而后利用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的小鼠单核巨噬细胞(RAW 264.7)炎症模型对芫花素的靶酶抑制作用进行药理学验证，采用单因素方差分析方法比较组间差异。结果芫花素可结合于靶标1KV2三维结构的活性位点处以干扰靶酶正常底物三磷酸腺苷的进入，对p38αMAPK的生物学功能产生抑制作用；细胞水平实验结果显示，芫花素在25、50和100μM浓度可明显降低LPS诱导的炎症模型细胞中的一氧化氮(nitric oxide, NO)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平，受试药物组与LPS模型组相比，NO和TNF-α的释放量差异有统计学意义(F=22.79、14.42,P<0.05),且呈现出明显的剂量依赖性。结论芫花素结合于p38αMAPK三维结构中的活性位点处而使靶酶的生物学功能得到抑制，最终表现出抗炎的药理活性。

关键词：
三维结构
丝裂原活化蛋白激酶p38α
分子对接
炎症模型
芫花素
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丝裂原活化蛋白激酶p38α(p38αMAPK)是一个经典的抗炎靶点[1-4],同时发现其与慢性阻塞性肺疾病､哮喘､神经元损伤以及肿瘤的发生发展有密切关系[5-13]｡芫花素是一种在植物界广泛存在的小分子黄酮类化合物,具有促成骨细胞分化､降糖､抗炎､抗痴呆等多种生物学活性[14-18],其抗炎的分子作用机制并未见相关研究报道｡本文利用分子对接软件研究芫花素与靶酶p38αMAPK活性位点处的分子间相互作用,发现其能较好的结合于活性位点处而阻碍正常底物进入,对靶酶生物学功能产生抑制作用,并应用LPS诱导的小鼠RAW264.7细胞炎症模型进行药理活性的实验验证,从分子间相互作用层面阐释芫花素抗炎机制,现将结果报道如下｡

1、材料与方法

1.1材料蛋白质结构数据库(proteindatabank,PDB);AutodockVina分子对接软件;芫花素单体化合物(成都曼思特生物科技有限公司,纯度≥98%,批号:22061711);地塞米松单体(购于北京索莱宝,批号:422A021)｡小鼠RAW264.7细胞系(中科院上海细胞库),DMEM(dulbecco′smodifiedeaglemedium)培养基(美国gbico公司,批号:6123038),胎牛血清(美国gbico公司,批号:2337715),青-链霉素(武汉普诺赛生命科技有限公司,批号:WH1022A161),二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)(细胞培养级)(北京索莱宝,批号:7103N0313),PBS(武汉普诺赛生命科技有限公司,批号:WHB822X181),细胞计数试剂(cellcountingkit-8,CCK-8)试剂盒(glpbio,批号:TN21),LPS(北京索莱宝,批号:L8880),磺胺(上海易恩化学技术有限公司,批号:20220819),盐酸萘乙二胺(北京索莱宝,批号:RH225172),ELISA试剂盒(北京索莱宝,批号:20221107)｡VICTORNivo酶标仪(赛默飞世尔)｡

1.2方法

1.2.1分子对接过程①利用软件Chemidraw14.0处理芫花素结构,采用MM2力场进行能量最小化优化保存成mo12格式,然后用软件Mgtools1.5.6处理,通过加氢,计算电荷及合并非极性氢后保存成pdbqt文件;②从蛋白质结构数据库PDB下载获得靶标蛋白的三维结构(1KV2),用Mgtools1.5.6软件处理蛋白结构,通过加氢､计算电荷､合并非极性氢后保存成pdbqt文件;③利用AutoDockVina软件行对接处理:以蛋白的活性位点(centerx=33.326,centery=33.725,centerz=17.372)为中心,构建一个60×40×60的盒子,通过Vina运算生成pdbqt文件;④结果分析:应用Pymol1.7.2.1软件打开生成的pdbqt文件,并打开1KV2蛋白结构,保存成复合物pdb文件,并进行相关作图处理｡

1.2.2细胞炎症模型相关活性测试试验利用LPS诱导的小鼠RAW264.7细胞制成炎症模型,对芫花素的药理进行实验验证｡LPS刺激可使细胞内p38αMAPK磷酸化激活,活化的p38αMAPK进一步将炎症信号向下游级联效应信号通路传递,最终致使炎症因子NO､TNF-α､IL-1､IL-6等水平升高,其中p38α下游底物丝裂原活化蛋白激酶激活蛋白激酶2(mitogen-activatedproteinkinase-activatedproteinkinase2,MAPKAPK2,即MK2)是TNF-α生物合成过程中的关键调控因子,p38αMAPK的抑制剂(如SB-203580､BIRB-796等)则可降低炎症模型中NO､TNF-α的水平[19-21]｡本实验设为空白组､LPS模型组､阳性对照药物组､受试药物组,每组设3个复孔,受试药物组为含芫花素浓度分别为25､50和100μM的含药培养基,阳性对照药物组为含地塞米松浓度分别为25､50和100μM的药物培养基｡

1.2.2.1细胞培养小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)株加入含10%胎牛血清､1%青-链霉素的改良DMEM培养基置于5%CO2培养箱中,37℃常规培养,隔天传代,细胞于对数生长期呈半贴壁状态生长至80%时用于后续实验｡

1.2.2.2单体化合物的细胞毒性检测测试地塞米松及芫花素高､中､低浓度梯度下的细胞存活率,将RAW264.7细胞系以2×105/ml的密度接种于96孔板,每孔100μl,贴壁后更换培养基;空白组､阳性对照药物组､受试药物组分别在用药干预的24h采用细胞增殖及CCK-8试剂法检测细胞活性;每孔加入10μl的CCK-8检测液,放入培养箱中37℃孵育1h,用酶标仪检测其在450nm处的吸光度,采用公式计算出细胞活性,细胞活性=[光密度(opticaldensity,OD)实验组-OD空白组]/(OD阴性组-OD空白组),依次计算得出地塞米松､芫花素的安全浓度以进行下一步试验｡

1.2.2.3NO释放量检测将RAW264.7细胞系以5×105/ml的密度接种于96孔板中,每孔100μl,贴壁后更换为空白组,LPS模型组,受试浓度分别为25､50和100μM的地塞米松阳性药物对照组和芫花素受试药物组,每组设3个复孔｡配制Grise试剂(实验通用方法的临时配制试剂,含亚硝酸钠标准液､1.0%磺胺､0.1%N-1-萘基乙二胺盐酸等),用酶标仪检测其在540nm处的吸光度,应用所得标曲y=0.0174x+0.1035[决定系数(coefficientofdetermination,R2)=0.9993]计算NO的释放量,采用公式抑制率(%)=1-(给药组释放量-空白组释放量)/(模型组释放量-空白组释放量)×100%,计算出阳性药物对照组､受试药物组的NO抑制率｡

1.2.2.4肿瘤坏死因子释放量检测将RAW264.7细胞系以5×105/ml的密度接种于96孔板中,每孔100μl,贴壁后更换为空白组､LPS模型组､阳性药物对照组､受试药物组｡地塞米松､芫花素浓度分别为25､50和100μM给药组,每组设3个复孔｡参照试剂盒说明书操作对TNF-α进行检测,在450nm波长处检测吸光度,利用标曲y=0.0013x+0.0560(R2=0.9996)计算得出TNF-α的释放量,采用公式抑制率(%)=1-(给药组释放量-空白组释放量)/(模型组释放量-空白组释放量)×100%,计算出阳性药物对照组､受试药物组的TNF-α抑制率｡1.2.3统计学方法采用SPSS21.0统计软件进行分析,实验数据以均数±标准差(x±s)表示,各组间差异比较采用单因素方差分析｡以P<0.05为差异有统计学意义｡检验水准α=0.05｡利用Prism7.0软件求得实验中各组测试样品的半抑制浓度(halfmaximalinhibitoryconcentration,IC50)值｡

2、结果

2.1分子对接结果分子对接结果显示,芫花素以非共价结合方式结合于蛋白1KV2的活性位点,占据嘌呤结合区域､疏水HPⅠ区和HPⅡ区(见图1),其中7-甲氧基伸入HPⅠ区域,4-羟基伸入HPⅡ区域,与蛋白活性位点处VAL30､VAL38､ALA51､LYS53､GLU71､LEU75､LEU104､VAL105､THR106､LEU108､LEU167､PHE169等氨基酸残基发生相互作用(二维平面结合见图2)｡芫花素与靶标1KV2对接过程中释放的自由能为-8.5kal/mol,可牢固地占据活性位点位置而阻碍正常底物三磷酸腺苷的进入｡

图1芫花素与1KV2的结合模式

2.2细胞炎症模型试验结果

2.2.1细胞毒性测试CCK-8法观察细胞经不同浓度的地塞米松､芫花素处理后细胞增殖活性的变化,结果显示,与空白组相比,阳性对照药地塞米松和芫花素单体在25､50和100μM浓度下的细胞存活率分别为100.00%､87.50%､83.33%和100.00%､87.80%､86.33%,细胞活力测试结果均>80.00%,可以用于进行后续实验｡

图2芫花素与1KV2结合的二维平面图

2.2.2NO释放量检测Grise试剂法结果显示,同体积空白组NO释放量为(0.067±0.043)μM,LPS模型组NO释放量为(8.664±0.417)μM,两组NO释放量差异有统计学意义(F=2.327,P<0.05),说明造模成功;与LPS模型组相比,阳性对照药物组､受试药物组在各浓度同剂量干预后可明显下调细胞上清液中NO水平,数值见表1｡受试药物组与LPS模型组相比,NO的释放量差异有统计学意义(F=22.790,P<0.05),两组NO抑制率见表2,进一步求得该实验中芫花素的IC50值为50.491μM,阳性对照药地塞米松的IC50值为9.318μM｡

表1测试样品组在炎症模型中NO释放量(x±s)

2.2.3TNF-α释放量检测ELISA结果显示,同体积空白组TNF-α释放量为(411.538±4.742)pg/ml,LPS模型组TNF-α释放量为(1958.974±31.082)pg/ml,两组TNF-α释放量差异有统计学意义(F=4.500,P<0.05),说明造模成功｡与LPS模型组相比,阳性对照药物组和受试药物组各剂量干预后可明显下调细胞上清液中上述炎症因子表达,数值见表3｡受试药物组与LPS模型组相比,TNF-α释放量的差异有统计学意义(F=14.42,P<0.05),TNF-α抑制率见表4｡试验显示,随着芫花素浓度的增加,抗炎作用不断增强,在100μM浓度下其抗炎活性强于地塞米松,并求得本实验中芫花素的IC50值为36.402μM,阳性对照药地塞米松的IC50值为9.648μM｡

表2测试样品组对炎症模型中NO抑制率(x±s)

表3测试样品组在炎症模型中TNF-α释放量(x±s)

表4测试样品组对炎症模型中TNF-α抑制率(x±s)

3、讨论

LPS作为胞外刺激物,能够通过丝氨酸蛋白激酶级联反应使p38αMAPK磷酸化激活,p38αMAPK继而激活其信号通路的下游底物(如MK2等),进而上调IL-1β､IL-6､TNF-α､一氧化氮合酶等的mRNA水平,最终使IL-1β､IL-6､TNF-α､NO等炎症因子水平升高｡p38αMAPK近来被认为是治疗慢性阻塞性肺病的一个关键靶点,受到广泛关注[8,22-24]｡笔者团队亦曾研究黄酮类和木质素类化合物与p38αMAPK活性位点的结合情况,并发现部分小分子化合物可抑制p38αMAPK的生物学功能[25-27]｡Zhang等[28]实验显示白杨素和芹菜素可通过抑制p38αMAPK/Akt激酶活性而抑制直肠癌的发生和发展,两者的药理作用可被加入的p38αMAPK激动剂茴香霉素逆转,说明化学结构与芫花素相近的黄酮类小分子白杨素和芹菜素可作用于p38αMAPK而发挥药理作用｡

本研究中,首先应用分子对接技术探究芫花素与靶酶p38αMAPK活性位点处的分子间相互作用,发现芫花素可较好地结合于1KV2的活性位点处从而对p38αMAPK的生物学功能产生抑制作用,而后行细胞水平药理学活性测试实验进行验证｡结果显示芫花素可明显降低LPS诱导细胞炎症模型中NO和TNF-α的水平,呈现出相关的剂量依赖性,说明芫花素极可能抑制p38αMAPK而表现出抗炎药理活性｡笔者认为,未来依据其与p38αMAPK活性位点的结合模型而行进一步结构修饰,以求得到结合能力更强､抗炎更好的新型酶抑制剂,可能成为研究治疗慢性阻塞性肺病､肿瘤等的一个重要思路｡本实验的局限性在于并未应用酶免疫测定技术检测磷酸化的MK2水平,从而未能更直观的表现芫花素对p38αMAPK的抑制作用,期待未来相关研究完成这一工作｡

参考文献:

[7]朱洽彬,陈斯宁,郑辛通,等.基于p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路探讨中医药治疗慢性阻塞性肺疾病的研究进展[J].中医临床研究,2023,15(12):35-41.

[10]杨灿,李学斌,孔庆霞,等.p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路在癫痫中的研究进展[J].癫痫杂志,2023,9(3):243-247.

[13]鲜文佳,李祖茂.p38MAPK信号转导通路与肿瘤关系的最新研究进展[J].临床医学研究与实践,2021,6(10):193-195.

[14]江友娅,陈琦,张露,等.芫花素对α-葡萄糖苷酶的抑制作用[J].食品工业科技,2021,42(15):43-47.

[15]贾军,费乔曼,邱曼曼,等.芫花素对于MC3T3-E1细胞向成骨细胞分化的影响[J].现代药物与临床,2020,35(1):12-15.

[16]柴秀丽,彭涛,郭富饶,等.芫花素对大鼠产后出血合并MODS氧化应激及凝血指标的影响[J].遵义医科大学学报,2020,43(6):716-721.

[17]王洪伦,付洋洋,铁芳芳.芫花素等黄酮类化合物对阿尔兹海默症的保护作用及其机制研究[J].青海科技,2023,30(4):46-55.

[18]肖正凤.芫花素对乙酰胆碱酯酶抑制作用研究[J].广州化工,2020,48(21):59-62.

[25]苏彦雷,张铭,赵海珍,等.络石藤中木质素类化合物与P38MAPK的分子对接研究[J].中华中医药学刊,2021,39(6):132-136,274-276.

[26]张铭,赵海珍,张莉,等.基于分子对接方法的木犀草素和罗汉松脂素与p38α激酶的分子作用机制研究[J].中国药师,2021,24(10):1847-1852.

[27]张铭,张莉,冉挺,等.络石藤中3个化合物与P38αMAPK靶酶的分子对接研究[J].西北药学杂志,2022,37(2):99-104.