宫颈癌属于妇科恶性肿瘤,其发病率､死亡率较高,严重危害女性健康[1-2]｡化疗是目前宫颈癌患者术后主要的辅助治疗方式,而顺铂是化疗的常用药物,但易产生耐药性,导致疗效达不到预期,是化疗失败､患者预后不良的主要原因之一[3-4]｡因此,逆转肿瘤耐药及相关机制的研究成为宫颈癌药物治疗的研究重点之一｡微小RNA(microRNA,miRNA)是一类内源性小分子RNA,参与细胞增殖､凋亡的过程[5]｡研究表明,miRNA-18a可以部分逆转乳腺癌MCF-7/PTX耐药细胞对紫杉醇的耐药性[6]｡槲皮素作为黄酮类化合物,具有抗氧化､抗炎､免疫调节等广泛的药理作用[7]｡近年来研究发现,槲皮素能抑制宫颈癌等癌细胞增殖､迁移和侵袭[8-9]｡本研究将槲皮素作用于顺铂处理的宫颈癌Hela/DDP细胞,基于miRNA-18a表达探讨槲皮素对Hela/DDP细胞顺铂耐药性的影响｡

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞人宫颈癌Hela细胞耐药亚株(Hela/DDP,货号:YB-ATCC-4511),美国ATCC公司;Hela细胞(货号:SCC-112011),美国ATCC公司｡

1.1.2主要试剂细胞裂解液(货号:AR0105),上海恒斐生物科技有限公司;RPMI-1640培养液(货号:GNM-31800),杭州吉诺生物医药技术有限公司;顺铂､槲皮素(货号:T1564､T6630),南京赛泓瑞生物科技有限公司;TRIzol试剂盒和Lipofectamine2000转染试剂(货号:15596026CN､11668019),美国Invitrogen公司;CCK-8试剂盒(货号:CK-04),日本同仁化学研究所;AnnexinV-FITC/PI试剂盒(货号:S0185),哈尔滨新海基因检测有限公司;实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitativereal-timePCR,qRT-PCR)试剂盒(货号:K1002S),美国Promega公司;NC-siRNA､miRNA-18a-siRNA及miRNA-18a､U6引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计并合成;B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)抗体､Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体､甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体(货号:ab194583､ab263897､ab181602),英国Abcam公司;辣根过氧化物酶标记的羊抗兔(货号:0295G-HRP),美国Santa公司;cDNA合成试剂盒､BCA蛋白定量试剂盒(货号:MR101-01､E112-01),南京诺唯赞生物科技股份有限公司｡

1.1.3主要仪器TY10GI2-2培养箱,美国Shellab公司;ABI7500荧光定量PCR仪,美国AppliedBiosystems公司;MODEL550酶标仪,美国Bio-Rad公司;BDFACSCantoⅡ流式细胞仪,美国BD公司;MG8000化学发光成像系统,美国Thmorgan公司｡

1.2实验方法

1.2.1细胞培养Hela/DDP､Hela细胞均用含10%胎牛血清､100U/mL链霉素､100U/mL青霉素的RPMI-1640培养液常规培养于培养箱,Hela/DDP细胞的培养基中另加终浓度1μg/mL的顺铂以维持耐药,每2~3d换液一次,观察细胞状态,传代3次后进行后续实验｡

1.2.2细胞分组将Hela/DDP､Hela细胞密度调整为1×105个/mL,以每孔100μL接种于96孔培养板,分别进行以下分组｡①Hela/DDP､Hela细胞设置不同浓度顺铂处理组:加入终浓度分别为0､5､10､20､40､80μg/mL的顺铂,检测各组Hela/DDP､Hela细胞增殖情况｡②Hela/DDP细胞设置对照组､顺铂组､低浓度槲皮素组､中浓度槲皮素组和高浓度槲皮素组:对照组不加入药物处理,顺铂组加入终浓度为10μg/mL的顺铂,低､中､高浓度槲皮素组分别加入终浓度为10μg/mL的顺铂及终浓度分别为20､40､80μmol/L的槲皮素,检测各组Hela/DDP细胞增殖､凋亡情况及细胞中miRNA-18a､Bcl-2蛋白､Bax蛋白表达｡③Hela/DDP细胞设置NC组､NC-siRNA组､miRNA-18a-siRNA组:NC组不进行转染处理,NC-siRNA组､miRNA-18a-siRNA组Hela/DDP细胞使用Lipofectamine2000转染试剂分别转染NC-siRNA､miRNA-18a-siRNA,3组均加入终浓度为10μg/mL的顺铂及80μmol/L的槲皮素,检测各组Hela/DDP细胞中miRNA-18a表达情况､细胞增殖及细胞凋亡情况｡每组设6个复孔｡

1.2.3CCK-8法检测Hela/DDP､Hela细胞增殖情况将处理后的Hela/DDP､Hela细胞培养48h,加入CCK-8试剂,继续培养2h,在酶标仪(450nm)检测光密度(OD)值,计算增殖抑制率(%)｡增殖抑制率=(1-OD药物处理组/OD对照组)×100%｡

1.2.4流式细胞仪检测Hela/DDP细胞凋亡情况将处理后的Hela/DDP细胞培养48h,收集细胞,消化､洗涤后调整为1×106个/mL的细胞悬浮液,加入5μLAnnexinV-FITC､5μLPI,避光孵育1h,立刻在流式细胞仪上检测细胞凋亡率｡

1.2.5qRT-PCR法检测Hela/DDP细胞中miRNA-18a表达情况将处理后的Hela/DDP细胞培养48h,收集细胞,TRIzol法提取总RNA,检验RNA浓度､纯度合格后,逆转录制备cDNA,qRT-PCR法检测miRNA-18a表达水平,以2-ΔΔCt法表示｡内参基因:U6｡反应程序:95℃5min,94℃30s,60℃30s,共循环45次｡miRNA-18a上游引物:5'-GTGCTAAGGTGCATCTAGCAG-3',下游引物:5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3';内参U6上游引物:5'-TCGCTTCGGCAGCAC-3',下游引物:5'-ACGCTTCACGAATTTGCG-3'｡

1.2.6蛋白免疫印迹(Westernblot)法检测Hela/DDP细胞中Bcl-2､Bax蛋白表达情况将处理后的Hela/DDP细胞培养48h,收集细胞,加入细胞裂解液静置,15000r/min离心10min提取细胞总蛋白,BCA法测定蛋白浓度｡行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳､转移目的蛋白于聚偏氟乙烯膜(PVDF),5%脱脂奶粉封闭1h,分别滴加稀释度均为1∶500的Bcl-2抗体､Bax抗体､GAPDH抗体,4℃孵育过夜,TBST缓冲液洗膜,加入稀释度为1∶4000的羊抗兔二抗,室温孵育1h,洗膜,化学发光法显色,拍摄图像,分析条带灰度值,以GAPDH为内参蛋白进行蛋白定量｡

1.3统计学方法采用GraphPadPrism7软件对数据进行统计学分析｡计量资料采用均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t或Dunn's-t检验｡P<0.05为差异有统计学意义｡

2、结果

2.1不同浓度顺铂对Hela/DDP､Hela细胞增殖的影响使用5､10､20､40､80μg/mL浓度的顺铂处理后,Hela/DDP细胞增殖抑制率均低于Hela细胞(P<0.05)｡顺铂对Hela细胞的半数抑制浓度(50%concentrationofinhibition,IC50)处于5~10μg/mL之间,对Hela/DDP细胞的IC50处于10~20μg/mL之间,Hela/DDP细胞对顺铂具有明显的耐药性,并选择10μg/mL为后续实验的顺铂处理浓度｡见表1｡

表1不同浓度顺铂处理的Hela/DDP､Hela细胞增殖抑制率比较

2.2不同浓度槲皮素对顺铂处理的Hela/DDP细胞增殖､凋亡的影响与对照组相比,顺铂组Hela/DDP细胞增殖率显著降低(P<0.05),凋亡率显著升高(P<0.05)｡与顺铂组相比,低､中､高浓度槲皮素组Hela/DDP细胞增殖率显著降低(P<0.05),凋亡率显著升高(P<0.05),且随着槲皮素浓度的升高,Hela/DDP细胞增殖率依次降低(P<0.05),凋亡率依次升高(P<0.05)｡见表2､图1｡

表2不同浓度槲皮素对顺铂处理的Hela/DDP细胞增殖､凋亡的影响

图1不同浓度槲皮素对顺铂处理的Hela/DDP细胞凋亡的影响

2.3不同浓度槲皮素对顺铂处理的Hela/DDP细胞中miRNA-18a表达水平的影响与对照组相比,顺铂组Hela/DDP细胞中miRNA-18a表达水平显著升高(P<0.05)｡与顺铂组相比,低､中､高浓度槲皮素组Hela/DDP细胞中miRNA-18a表达水平显著升高(P<0.05),且随着槲皮素浓度的升高,Hela/DDP细胞中miRNA-18a表达水平依次升高(P<0.05)｡见表3｡

表3不同浓度槲皮素对顺铂处理的Hela/DDP细胞中miRNA-18a表达水平的影响

2.4不同浓度槲皮素对顺铂处理的Hela/DDP细胞中Bcl-2､Bax蛋白表达水平的影响与对照组相比,顺铂组Hela/DDP细胞中Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.05),Bax蛋白表达水平显著升高(P<0.05)｡与顺铂组相比,低､中､高浓度槲皮素组Hela/DDP细胞中Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.05),Bax蛋白表达水平显著升高(P<0.05)｡随着槲皮素浓度的升高,Hela/DDP细胞中Bcl-2蛋白表达水平依次降低(P<0.05),Bax蛋白表达水平依次升高(P<0.05)｡见表4､图2｡

表4不同浓度槲皮素对顺铂处理的Hela/DDP细胞中Bcl-2､Bax蛋白表达水平的影响

图2不同浓度槲皮素对顺铂处理的Hela/DDP细胞中Bcl-2､Bax蛋白表达条带图

2.5下调miRNA-18a表达对槲皮素逆转Hela/DDP细胞顺铂耐药性的影响NC组与NC-siRNA组Hela/DDP细胞中miRNA-18a表达水平及OD值､凋亡率比较差异无统计学意义(P>0.05)｡与NC-siRNA组相比,miRNA-18a-siRNA组Hela/DDP细胞中miRNA-18a表达水平及细胞凋亡率均显著降低(P<0.05),OD值显著升高(P<0.05)｡见表5､图3｡

表5下调miRNA-18a表达各组Hela/DDP细胞miRNA-18a表达及OD值､细胞凋亡率比较

图3下调miRNA-18a表达各组Hela/DDP细胞凋亡情况

3、讨论

宫颈癌是女性常见恶性肿瘤,据调查,全世界范围内每年新发宫颈癌病例约有500000例,死亡病例约有230000例[10]｡我国宫颈癌发病率为10.3/10万,死亡率为2.5/10万,近年来发病年龄有年轻化趋势[11]｡放化疗均为辅助宫颈癌患者术前､术后的常用治疗手段[12],而化疗耐药是导致肿瘤治疗疗效不佳及患者预后不良的重要原因[13]｡因此,寻找逆转宫颈癌化疗耐药性的治疗手段具有重要意义｡顺铂是宫颈癌细胞化疗常用药物,本研究通过浓度梯度实验,验证了Hela/DDP细胞在5､10､20､40､80μg/mL浓度顺铂处理下均有耐药性产生,并根据细胞增殖抑制率选择10μg/mL作为后续实验中顺铂的处理浓度｡

宫颈癌在中医学被认为属于“癥瘕”“崩漏”等范畴,多为脏腑失和,正气不足,冲任失调,湿热瘀毒凝结而成[14]｡近年来,中草药的抗肿瘤作用越来越受到重视｡槲皮素是从益母草､高良姜､侧柏叶等中药材中提取出的黄酮类化合物,具有多种生物活性,可发挥免疫调节､抗病毒､抗氧化､抗肿瘤等多种作用[15]｡Zhou等[16]研究表明,槲皮素可以显著抑制肝癌HepG2细胞增殖,减缓肿瘤生长速度,提高肝癌小鼠存活率｡Li等[17]研究表明,槲皮素可通过下调P-糖蛋白表达,消除由Y-box结合蛋白1核易位介导的乳腺癌干细胞,进而逆转乳腺癌细胞的多药耐药性｡本研究结果表明,在顺铂降低Hela/DDP细胞增殖并提高凋亡率基础上,随着槲皮素的使用及浓度的升高,可进一步降低Hela/DDP细胞增殖率,提高细胞凋亡率,提示槲皮素可有效提高Hela/DDP细胞对顺铂的敏感性,减少细胞耐药性发生｡Bcl-2､Bax均为Bcl-2家族成员,分别发挥抑制细胞凋亡和促进细胞凋亡的作用[18]｡本研究结果显示,随着槲皮素的使用及浓度的升高,Hela/DDP细胞中Bcl-2蛋白表达水平逐步降低,Bax蛋白表达水平逐步升高,提示槲皮素可影响Hela/DDP细胞中Bcl-2､Bax蛋白表达水平,加强顺铂抑制Hela/DDP细胞增殖､诱导Hela/DDP细胞凋亡作用,但具体机制还需进一步研究｡

miRNAs是包括宫颈癌在内的多种肿瘤细胞增殖､凋亡､放疗抵抗､化疗耐药性的关键调节基因,已广泛用于癌症的诊断及治疗中[19]｡熊汉真等[12]研究发现,miR-200c可增强HeLa/DDP细胞对顺铂的敏感性,其机制与下调叉头框C1表达有关｡Morgan等[20]研究表明,MicroRNA-18a靶向丝氨酸苏氨酸激酶4肿瘤抑制因子,在人乳头状瘤病毒阳性宫颈癌的转化过程中发挥重要的作用｡Zhu等[21]研究发现,长链非编码RNAUCA1可通过抑制miR-18a使乳腺癌细胞对曲妥珠单抗脱敏｡Kim等[22]研究表明,槲皮素可通过调控miRNA在癌症治疗和化学保护中发挥作用｡本研究结果显示,顺铂处理后,Hela/DDP细胞中miRNA-18a表达水平显著升高,随着槲皮素的使用及浓度的升高,Hela/DDP细胞中miRNA-18a表达水平进一步升高,提示miRNA-18a水平升高可能与顺铂､槲皮素对Hela/DDP细胞增殖､凋亡的调控有关｡进一步研究发现,抑制miRNA-18a表达后,顺铂､槲皮素处理的Hela/DDP细胞凋亡率显著降低,细胞增殖OD值显著升高,提示下调miRNA-18a表达可减弱槲皮素对Hela/DDP细胞顺铂耐药性的逆转作用,推测槲皮素逆转Hela/DDP细胞的顺铂耐药性过程可能与上调miRNA-18a表达有关｡

综上所述,槲皮素可抑制宫颈癌Hela/DDP细胞增殖并诱导细胞凋亡,对Hela/DDP细胞顺铂耐药性具有一定逆转作用,且可能是通过上调miRNA-18a表达发挥作用｡但宫颈癌细胞顺铂耐药过程复杂,参与发挥作用的miRNA众多,是否有其他miRNA也在槲皮素逆转宫颈癌顺铂耐药过程中发挥作用,还需进一步研究｡

参考文献:

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[6]孟庆榆,刘淑杰,代春梅,等.MicroRNA-18a对乳腺癌细胞MCF-7/PTX紫杉醇耐药性的影响[J].武汉大学学报:医学版,2020,41(2):225-230.

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[9]唐阳芳,陈蕊,张少华.槲皮素对宫颈癌HeLa细胞凋亡､迁移的影响[J].山西医科大学学报,2020,51(7):609-615.

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[12]熊汉真,谭学贤,刘少颜,等.miR-200c通过靶向下调FOXC1逆转宫颈癌细胞顺铂耐药性的机制研究[J].现代妇产科进展,2019,28(7):486-489,494.

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[14]王楚伊赢,曹莹,陈璐,等.从湿热探讨人乳头状瘤病毒与宫颈癌的关系[J].现代中医临床,2023,30(4):84-87.

[15]张欣,董春力,付丽丽,等.槲皮素对宫颈癌细胞C33A增殖和凋亡的影响[J].安徽医学,2018,39(4):400-403.

基金资助:十堰市太和医院科研项目(编号:2020JJXM105);

文章来源:余琴,刘艳,柯娟,等.槲皮素对宫颈癌Hela/DDP细胞顺铂耐药性的影响及作用机制研究[J].河北中医,2025,47(03):456-460+467.