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三七总皂苷通过ADAM10/Notch3信号通路干预大鼠PASMCs增殖

2025-04-03 51 上传者：管理员

摘要：目的：探讨在野百合碱（MCT）作用下三七总皂苷（PNS）对大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）增殖的干预作用及其机制。方法：体外培养的PASMCs随机分为正常对照（Control）组、野百合碱（MCT）组、三七总皂苷（PNS）组、敲低（M+Si ADAM10）组、敲低后处理（M+P+Si ADAM10）组、过表达（M+OE ADAM10）组和过表达后处理（M+P+OE ADAM10）组。造模结束后，采用CCK-8法测各组细胞活力；蛋白质免疫印迹（Western blot）法分别检测细胞增殖细胞核抗原（PCNA）、解整合素金属蛋白酶10(ADAM10)、细胞神经源性基因座notch同源蛋白-3(Notch3)蛋白的表达情况。结果：在MCT作用下，PASMCs活力显著增强（P<0.05或P<0.01）;0～400 mg/L的PNS对正常细胞活力无毒性，100 mg/L的PNS可显著抑制MCT诱导的细胞活力（P<0.01）。在敲低ADAM10后PASMCs活力显著减弱（P<0.01）,PCNA蛋白表达明显下降（P<0.05），尤以M+P+Si ADAM10组为著；ADAM10、Notch3蛋白表达均显著下降（P<0.05或P<0.01），尤以M+P+Si ADAM10组为著。过表达ADAM10后PASMCs活力显著增强（P<0.01）,PCNA蛋白表达明显增高（P<0.01）,M+P+OE ADAM10组PCNA值稍偏高（P>0.05）,ADAM10、Notch3蛋白表达均显著升高（P<0.05）；而过表达ADAM10的同时使用PNS的PASMCs与敲低ADAM10的PASMCs相比，PCNA蛋白表达显著下降（P<0.01）,ADAM10、Notch3蛋白表达不同程度降低（P>0.05）。结论：PNS可能通过抑制ADAM10/Notch3信号通路，减弱大鼠MCT诱导的PASMCs增殖。

关键词：
ADAM10/Notch3通路
PAH
三七总皂苷
肺动脉平滑肌细胞
野百合碱
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肺动脉高压(pulmonaryarterialhyperten‐sion,PAH)是一种血管进行性且预后不良的疾病,患者肺血管阻力(pulmoncaryvasculerresis‐tance,PVR)持续升高,最终可因右心衰竭而死亡[1]｡最新流行病学数据显示原发性PAH发病率和患病率逐年增加趋势明显[2],然而目前的治疗手段十分有限,我国PAH治疗生存率有所上升,但也已进入平台期[3];因此,深入探究PAH的发病机制及作用靶点对于治疗PAH十分必要,同时有利于新的治疗药物的研发｡

研究证实[4],多种病因导致PAH发生时,肺血管平滑肌Notch3信号表达增强,并且发现其与平均肺动脉压呈正相关[5],提示Notch3信号可能在PVR中起重要作用｡Notch3激活后,Notch3胞内结构域(notchintracellulardomain,NICD3)释放到细胞质中,随后进入细胞核,激活下游靶基因转录[6]｡近期的大量研究表明解整合素金属蛋白酶10(recombinantadisintegrinandmetalloprote‐ase10,ADAM10)在正常发育以及各种疾病中对启动Notch信号通路起着关键作用,ADAM10可以通过蛋白水解性剪切Notch受体释放Notch胞内段(NICD)活化Notch信号通路[7]｡本实验室先前研究发现,三七总皂苷(Panaxnotoginsengsa‐poninstotal,PNS)可通过JNK､p38MAPK等相关通路缓解低氧高二氧化碳性PAH[8]｡但是,PNS是否还通过ADAM10/Notch3信号通路抑制肺动脉平滑肌细胞(pulmonaryarterysmoothmusclecells,PASMCs)增殖来改善PAH尚不清楚｡基于以上原因,本研究旨在探讨ADAM10/Notch3信号通路在大鼠PASMCs中的作用及PNS的干预效果,为PAH的临床防治提供新的治疗突破口｡

1、材料与方法

1.1材料与试剂大鼠肺动脉平滑肌细胞购自北京中科质检生物技术有限公司;野百合碱(monocrotaline,MCT)购自适马股份有限公司(批号RHS-Y01711809011);羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)购于Biosharp科技有限公司;兔抗鼠ADAM10抗体(批号SC48400)购于艾博抗(上海)贸易有限公司;兔抗鼠Notch和增殖细胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen,PCNA)抗体购于CellSignalingTechnology｡

1.2细胞造模及分组PASMCs常规培养长至75%后,细胞饥饿24h,随机分为正常对照(Con‐trol)组､野百合碱(MCT)组､三七总皂苷(PNS)组､敲低(M+SiADAM10)组､敲低后处理(M+P+SiADAM10)组､过表达(M+OEADAM10)组和过表达后处理(M+P+OEADAM10)组,根据不同实验分组加入不同的培养混合液｡正常对照组常规处理;野百合碱组用10%DMEM高糖培养液培养,PNS组在MCT处理基础上加入100mg/LPNS,M+SiADAM10组在MCT处理基础上加入SiRNA,M+P+SiADAM10组在前一组处理情况下加入100mg/LPNS,M+OEADAM10组在MCT处理基础上加入过表达质粒,M+P+OEADAM10组在前一组处理情况下加入100mg/LPNS,后均置于造模箱内(21%O2,5%CO2,89%N2,37℃)培养48h[9]｡

1.3CCK-8检测细胞的活力PASMCs按每孔8000个细胞接种于96孔板中,不同处理造模之后,每孔加入110μLCCK-8和培养基的混合液,置于培养箱中37℃孵育1h,随后用酶标仪测定450nm处吸收光密度值(opticaldelnsity,OD),取每组的平均值,重复3次实验｡

1.4WesternBlot法检测各组细胞PCNA､AD‐AM10､Notch3的蛋白表达水平取造模结束的细胞置于冰上,PBS清洗后加入约1mL细胞裂解液,离心后收集上清｡用BCA试剂盒测蛋白总浓度｡每组加总上样量1/5体积的loadingbuffer,混合后煮沸10min备用｡以每孔40µg的蛋白上样量进行电泳,转膜结束后用10%脱脂牛奶中室温封闭1.5h｡Ⅰ抗(ADAM10､Notch3和PCNA抗体,1:1000)4℃冰箱过夜｡次日洗涤后孵Ⅱ抗(1:10000)｡孵育完成后,将漂洗后的PVDF膜置于曝光仪中,滴加化学发光液,曝光并保存结果｡

1.5统计学处理采用SPSS13.0软件对各组的实验数据进行统计学分析｡实验数据以均数±标准差(xˉ±s)表示｡数据呈正态分布时,两组样本进行比较选用t检验,多组样本间比较用单因素方差分析(one-wayANOVA),P0.05表示差异有统计学意义｡

2、结果

2.1不同浓度PNS对PASMCs活力的干预CCK-8结果显示:与正常对照组比较,PNS25~200mg/L组的细胞活性无明显变化,浓度>400mg/L开始细胞活力明显降低(P<0.05),400~1600mg/L浓度范围内细胞活力过低,表明PNS对细胞产生较大毒害作用｡因此,在后续实验中使用200mg/L以下的PNS浓度继续后续研究｡CCK-8结果显示:与正常对照组比较,野百合碱组PASMCs活性明显增强(P<0.01),PNS100~200mg/L组的细胞活性开始出现明显下降(P<0.01)｡因此后续选择100mg/LPNS用于抑制PASMCs的增殖实验｡见Fig.1｡

2.2各组SiADAM10和OEADAM10大鼠PASMCs的活力比较CCK-8结果显示:与正常对照组比较,野百合碱组PASMCs活力明显增强(P<0.01),与野百合碱组比较,转染ADAM10SiRNA序列后,PASMCs的细胞活力显著低于野百合碱组(P<0.01),其效果和PNS作用相似(P<0.01),尤以M+P+SiADAM10组为著,表示SiADAM10模型建立成功｡

CCK-8结果显示:与正常对照组比较,野百合碱组PASMCs活力明显增强(P<0.05);与野百合碱组比较,PNS组PASMCs活力明显减弱(P<0.01),M+OEADAM10组PASMCs活力显著增强(P<0.01),M+P+OEADAM10组PASMCs活力稍下降(P>0.05);与M+OEADAM10组比较,M+P+OEAD‐AM10组PASMCs活力显著减弱(P<0.01),表示OEADAM10模型建立成功｡见Fig.2｡

2.3PNS对SiADAM10大鼠PASMCsPCNA､AD‐AM10､Notch3蛋白表达的影响Westernblot结果显示:与正常对照组比较,野百合碱组PCNA､ADAM10､Notch3蛋白表达水平明显增高(P<0.01);与野百合碱组比较,PNS组､M+SiAD‐AM10组､M+P+SiADAM10组PCNA､ADAM10､Notch3蛋白表达水平均显著降低(P<0.01),尤以PNS组､M+P+SiADAM10组为著｡见Fig.3｡

2.4PNS对过表达ADAM10大鼠PASMCsPCNA､ADAM10､Notch3蛋白表达的影响WesternBlot结果显示:与正常对照组比较,野百合碱组PC‐NA､ADAM10､Notch3蛋白表达水平明显升高(P<0.05或P<0.01);与野百合碱组比较,PNS组PC‐NA､ADAM10､Notch3蛋白表达水平显著降低(P<0.05或P<0.01),M+OEADAM10组PCNA值显著增高(P<0.01),M+P+OEADAM10组PCNA值稍偏高(P>0.05);与M+OEADAM10组比较,M+P+OEAD‐AM10组PCNA值显著下降(P<0.01),而ADAM10过表达部分反转了PNS下调ADAM10以及Notch3蛋白表达的作用(P<0.05或P<0.01)｡见Fig.4｡

3、讨论

PASMCs主要存在于肺血管壁介质中,其异常增殖和迁移是肺血管重塑的主要特征[9-10]｡PASMCs增殖和凋亡异常失衡是导致PAH的主要原因[11-12]｡在PAH患者中,可以观察到PASMCs的过度增殖｡因此,抑制细胞增殖,逆转血管重塑成为PAH的一个新的治疗概念[13]｡

三七为五加科植物的干燥根及根茎,又名参三七､田七,是中医治疗心脑血管疾病的名贵中药,有散瘀止血､消肿定痛的功效｡其化学成分主要包括有人参皂苷､三七皂苷､三七素及多糖,其中PNS是主要有效成分[14],主要应用于心脑血管疾病以及免疫､老年痴呆､肿瘤等疾病｡到目前为止,临床上常使用的PNS制剂为注射液和胶囊,如血栓通注射液和血塞通胶囊等｡

ADAM10是属于基质金属蛋白酶(matrixme‐talloproteinases,MMPs)的甲嗪霉素超家族的AD‐AMsheddases的成员,是一种细胞表面金属蛋白酶,参与各种生理过程,如发育过程中Notch信号通路的激活和炎症/免疫反应[15]｡ADAM10活性的失调与某些人类疾病的病理过程有关,尤其是在脑部疾病中[16]｡例如,ADAM10的上调导致淀粉样前体蛋白(APP)的α-分泌酶断裂,并被认为是治疗阿尔茨海默病的有效方法｡根据相关文献报道[17],Notch信号通路主要由Notch受体､配体和细胞内效应分子(CBF1/suppressorofhairless/Lag1,CSL)组成,其同源配体包括Dll-1､Dll-3､Dll-4､Jag-1和Jag-2｡CSL为核转录因子,能够识别Notch通路下游的靶基因并与其启动子上DNA序列结合,发挥生物学效应[18]｡PCNA是一个细胞周期蛋白[19],主要在细胞增殖过程中发挥重要作用,以此作为检测PASMCs增殖的重要指标[20-21]｡

本实验结果显示,100mg/L的PNS可明显抑制MCT诱导的PASMCS增殖与活力｡在沉默AD‐AM10后PASMCs增殖与活力显著减弱,PCNA蛋白表达明显下降,同时加用PNS后下调更为显著;ADAM10､Notch3蛋白表达均显著下降,同时加用PNS后两者蛋白表达下调更为明显｡过表达ADAM10后PASMCs活力显著增强,PCNA蛋白表达明显增高,M+P+OEADAM10组PCNA值稍偏高,ADAM10､Notch3蛋白表达均显著升高;而过表达ADAM10的同时使用PNS的PASMCs与敲除ADAM10的PASMCs相比,PCNA蛋白表达显著下降,ADAM10､Notch3蛋白表达不同程度降低｡本研究结果表明,PNS可抑制MCT诱导的大鼠PASMCS增殖,其机制可能是通过下调ADAM10/Notch3信号通路而实现｡

参考文献:

[1]樊芳芳,施熠炜《.中国肺动脉高压诊断与治疗指南(2021版)》解读:肺动脉高压诊断流程[J].国际呼吸杂志,2022,42(5):326-331.

[7]王博石,郑煜芳,王红艳,等.NOTCH信号通路基因JAG1､ADAM17和ADAM10与先天性心脏病(CHD)的相关性[J].复旦学报,2014,41(6):734-741.

[8]朱阿楠,王园园,王淑君,等.ERK通路和三七总皂苷干预在低氧高二氧化碳性肺动脉高压中的作用[J].中国病理生理杂志,2011,27(9):1796-1801.

[9]白相书,黄曼,田云娜,等.三七总皂苷对低氧状态下大鼠PASMCs增殖､凋亡及Notch3通路的影响[J].中国病理生理杂志,2023,39(10):1765-1772.

[15]李青融,王子妤.三七总皂苷药理作用的研究进展[J].湖南中医杂志,2017,33(9):216-218.

[20]王慧敏,斯琴,王方颖,等.血清PCNA､MIC-1及Hcy水平与非小细胞肺癌患者预后的相关性分析[J].临床肺科杂志,2022,27(1):93-97.

基金资助:浙江省介入肺脏病重点实验室建设项目(2019E10014);温州市基础性科研项目(2024Y3124);

文章来源:黄曼,白相书,田云娜,等.三七总皂苷通过ADAM10/Notch3信号通路干预大鼠PASMCs增殖[J].中国临床药理学与治疗学,2025,30(04):487-492.