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红花黄色素对大鼠脑缺血再灌注损伤及PI3K/AKT通路的影响

2025-05-30 65 上传者：管理员

摘要：目的研究红花黄色素对大鼠脑缺血再灌注损伤及PI3K/AKT通路的影响。方法将成年雄性SD大鼠，随机分为Sham组(假手术)、Model组(缺血再灌注模型)和Treatment组(红花黄色素预处理+缺血再灌注模型),每组11只。采用酶联免疫吸附测定法(ELISA法)检测炎症因子[肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)]的表达；苏木精-伊红染色(HE染色)评估海马CA1区的细胞形态；采用蛋白质印迹法检测PI3K/AKT通路的蛋白表达。结果与Sham组比较，Model组脑缺血后炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达均升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与Model组比较，Treatment组炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6均明显下降(P<0.05);与Sham组比较，Model组和Treatment组神经功能缺损评分升高(P<0.05);与Model组比较，Treatment组神经功能缺损评分下降(P<0.05);与Sham组相比，Model组PI3K、AKT蛋白表达升高(P<0.05);与Model组比较，Treatment组PI3K、AKT蛋白表达下降(P<0.05)。结论红花黄色素可抑制脑缺血再灌注所致的炎症反应，并通过调控PI3K/AKT通路抑制病理性过表达，从而减轻大鼠脑缺血再灌注损伤。

关键词：
CIRI
炎症反应
红花黄色素
缺血再灌注损伤
脑卒中
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脑卒中是全球死亡和残疾的主要原因｡缺血性脑卒中是脑卒中常见的类型之一[1],其治疗的首要原则是尽快构建血液再通,但受时间窗限制,只有小部分患者能进行血管再通治疗[2]｡缺血性脑卒中患者在缺血再灌注后,可加重缺血脑组织的病理损害,即发生脑缺血再灌注损伤(cerebralischemia-reperfusioninjury,CIRI),导致患者认知功能､运动能力严重受损[3]｡CIRI的病理过程复杂,其中氧自由基介导的脂质过氧化反应､炎症反应､神经细胞凋亡等因素起着重要作用｡

缺血性脑卒中炎症反应会激活小胶质细胞､巨噬细胞､T淋巴细胞等多种免疫细胞,而活化的小胶质细胞会分泌大量肿瘤坏死因子α(tumournecrosisfactor-α,TNF-α)､白细胞介素1β(interleukin-1beta,IL-1β)､白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)等促炎细胞因子和趋化因子,共同诱导免疫细胞粘附血管壁,进而浸润中枢神经系统,破坏血脑屏障,导致细胞水肿和神经细胞凋亡[4]｡

神经细胞凋亡是继发性脑组织损伤的重要途径之一,在脑组织缺血再灌注过程中,脑组织细胞间质呈现大片出血､胞浆空泡化､细胞核固缩等神经细胞的早期凋亡征象[5]｡脑组织急性损伤后局部产生的大量细胞因子,可诱导细胞内凋亡蛋白的激活,启动细胞凋亡程序,通过多种信号传递通路触发细胞死亡｡磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide3-kinase-Akt,PI3K/AKT)是细胞内重要的信号转导通路,通过作用于下游多个靶点,从而促进细胞增殖和抑制细胞凋亡[6]｡

中医药对缺血再灌注损伤的防治具有其独特的优势,可多方位､多靶点防治CIRI｡红花黄素注射液是基于传统中药红花的现代化制剂,其主要有效成分为羟基红花黄色素A(hydroxysaffloryellowA,HSYA),具有改善微循环､抑制炎症因子和神经细胞凋亡等多种药理学功效[7]｡

脑缺血再灌注后缺血区域神经元以程序性死亡为主｡研究[8]发现,脑缺血再灌注过程中细胞存活受PI3K/AKT信号通路调控｡缺血性脑卒中患者在脑缺血再灌注后,患者的神经功能受损发生率较高,其具体机制尚不明确｡目前,关于红花黄色素对大鼠缺血性脑卒中保护作用的研究较少,因此本研究旨在探讨红花黄色素对大鼠缺血性脑卒中的药效作用,以期为预防脑缺血再灌注损伤提供新路径｡

1、材料与方法

1.1实验动物

成年雄性SD大鼠(33只)购自湖南史莱克景达实验动物有限公司,体重(265±15)g,所有大鼠均适应性饲养1周,可自由获取食物和水｡本研究通过肇庆市医学高等专科学校伦理审查委员会批准(2020-010)｡

1.2药物与试剂

红花黄色素氯化钠注射液(商品名:西克,规格:100mL∶80mg,国药准字Z20050582)购自山西德元堂药业有限公司;TNF-α､IL-6､IL-1βELISA试剂盒购自江苏酶免实业有限公司;苏木素染液购自北京中衫金桥生物技术有限公司;伊红染色液Scott蓝化液购自北京索莱宝科技有限公司;超净高级封片胶购自珠海贝索生物技术有限公司;TrizonReagen购自江苏康为世纪生物科技股份有限公司｡

1.3模型建立与分组

采取随机数字表法,将SD大鼠随机分为Sham组(假手术)､Model组(缺血再灌注模型)和Treatment组(红花黄色素处理+缺血再灌注模型),每组11只｡所有大鼠适应性饲养1周后,腹腔注射10%水合氯醛(320mg/kg),使用线栓法建立脑缺血再灌注模型｡1)分离颈动脉:颈部正中切口钝性分离右侧颈总动脉至分叉处,双重结扎颈总动脉近心端及颈外动脉,微型动脉夹闭锁颈内动脉;2)插入线栓:于颈总动脉分叉远端1mm处行血管穿刺,导入线栓阻断大脑中动脉血流｡Sham组只分离血管不结扎,Model组和Treatment组大鼠在颈内动脉插入MOG线栓(型号:2838-A5,北京西浓科技有限公司),2h后拔出线栓(模拟脑缺血再灌注),术后大鼠置保温毯复苏,清醒后转入标准饲养环境｡

1.4给药

在建立缺血再灌注模型后,Treatment组拔出线栓前2min经尾静脉注射红花黄色素(10mg/kg),Sham组及Model组小鼠不作处理｡

1.5神经功能缺损评分

采用Zealonga神经功能缺损评分评估3组大鼠的神经行为功能｡

1.6酶联免疫吸附检测

建立缺血性脑卒中模型24h后,纳入Zealonga神经功能缺损评分为1~3分的大鼠｡采集大鼠外周血,离心取血清,使用ELISA法检测大鼠血清中炎症相关因子(TNF-α､IL-1β､IL-6)的表达,所有操作严格遵循试剂盒说明书操作进行｡

1.7苏木精-伊红染色

采血完成后麻醉处死大鼠,暴露大鼠胸部,将针插入心尖并切开右心耳进行全身灌注;灌注成功后脑组织呈白色､僵硬状态,剥离大鼠颅骨时注意硬脑膜,避免损伤脑组织,从延髓开始缓慢分离颅底组织取出大脑;将脑组织进行脱水包埋;然后制备4μm的脑组织冠状切片行HE染色;最后在显微镜下观察海马CA1区的形态和病理变化,并对图像进行分析｡

1.8蛋白质印迹法检测

海马组织经-20°C碾磨,加入100μL裂解液冰浴20min,转移至EP管离心取上清;蛋白浓度按BCA试剂盒说明书测定,蛋白样本变性后行SDS-PAGE电泳及恒压转膜;一抗4°C孵育,二抗室温孵育,ECL显影后通过凝胶成像系统采集图像,选用ImageJ软件(Fiji版)分析条带灰度值｡

1.9统计学方法

采用GraphPadPrism5.0统计软件进行数据统计分析｡定量资料以(x±s)描述,组间比较采用ANOVA单因素方差分析,事后两两比较采用SNK法｡检验水准α除特别说明外均设定为0.05｡

2、结果

2.1红花黄色素对大鼠血清炎症因子的影响

与Sham组比较,Model组脑缺血后炎症因子表达均上升,差异有统计学意义(P<0.05)｡与Model组比较,注射红花黄色素后Treatment组炎症因子下降,差异有统计学意义(P<0.05)(图1)｡

图1红花黄色素对大鼠血清炎症因子的影响

2.2红花黄色素对大鼠神经功能缺损评分及海马CA1区组织形态学的影响

Sham组没有进行脑缺血再灌注,其神经功能缺损评分最低｡与Sham组比较,Model组和Treatment组的神经功能缺损评分升高(P<0.05);与Model组比较,Treatment组神经功能缺损评分有所下降,差异有统计学意义(P<0.05)｡Sham组大鼠左侧海马CA1区的细胞排列规整,核大而圆,核仁清晰｡与Sham组比较,Model组大鼠左侧海马CA1区的细胞排列比较散乱,核小色暗､核仁不清,核固缩,细胞出现空泡,且炎性细胞增加｡Treatment组海马CA1区细胞损伤程度比Model组轻,偶见空泡变性,未见明显细胞凋亡及炎细胞浸润(图2)｡

图23组大鼠左侧海马CA1区HE染色结果和神经功能缺损评分

2.3红花黄色素对PI3K､AKT蛋白表达的影响

与Sham组相比,Model组PI3K､AKT蛋白表达升高(P<0.05);与Model组比较,Treatment组PI3K､AKT蛋白表达下降(P<0.05)(图3)｡

图3红花黄色素对PI3K/AKT通路中AKT､PI3K蛋白表达的影响

3、讨论

缺血性脑卒中是由于血管狭窄或闭塞后,脑动脉供血中断,相应供血区域因持续性血流中断导致神经组织缺血性坏死及神经功能缺损,最终引发功能残疾等常见的脑血管疾病,给患者家庭和社会带来沉重负担,是全球性的公共卫生问题[9]｡目前,治疗缺血性脑卒中仍然缺乏有效的药物,研究改善脑卒中患者神经功能的治疗方法具有重要的临床意义｡

红花主要含黄酮类物质,其中HYSA是红花黄色素中的主要有效成分[10]｡HYSA具有抗血栓作用,通过抗氧化､抑制炎症反应､抑制细胞凋亡保护神经系统[11],在临床研究中红花黄色素在防治脑卒中疗效确切[12],但其作用机制尚未完全阐明,因此本研究探讨红花黄色素对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响｡

本研究中,与Sham组相比,Model组大鼠的神经功能缺损评分明显升高,表明大鼠的大脑中动脉经缺血2h后再通,对相应供血区域的脑组织造成一定损伤,导致脑区所支配的躯体功能改变或缺失;而Treatment组在脑缺血再灌注前通过静脉注射红花黄色素,其神经功能缺损评分较Model组明显下降,表明红花黄色素可保护神经功能;3组大鼠海马CA1区的HE染色中神经元凋亡与神经功能评分一致,其中Model组出现细胞凋亡与空泡的数量最多,Treatment组的海马CA1区神经元的形态学损伤较Model组有所改善｡

细胞凋亡又称程序性细胞死亡,是受遗传机制调控的自主性消亡过程,一系列蛋白质家族调节该过程｡PI3K/AKT通路作为关键的细胞内信号传导通路,参与调控蛋白合成､能量代谢及细胞增殖等方面,其中PI3K在生长因子的信号转导过程中起着重要作用,胞外信号如胰岛素受体､酪氨酸激酶受体､非酪氨酸激酶受体等均可激活PI3K｡AKT是PI3K/AKT信号转导途径中重要的下游靶点,在细胞增殖､生长与凋亡的过程中具有枢纽作用,其活化形式通过修饰转录因子的活性或抑制凋亡信号蛋白磷酸化,从而调节细胞凋亡[13]｡

本研究中,Model组大鼠在脑缺血再灌注后血清炎症因子增加,PI3K/AKT信号通路蛋白表达升高,表明大鼠在脑缺血再灌注后神经功能缺损评分增高,与细胞炎症因子增加及过度激活PI3K/AKT信号通路相关｡而接受红花黄色素处理的大鼠在脑缺血再灌注后PI3K/AKT信号通路蛋白表达比Model组明显下降,表明红花黄色素能抑制炎症因子的产生,可通过调控PI3K/AKT信号通路,减少神经元的变性与凋亡,从而改善大鼠在脑缺血再灌注后的神经功能缺损评分,与相关研究[14]结果一致｡

综上所述,红花黄色素可抑制脑缺血所致的炎症反应,改善缺血性脑卒中模型大鼠海马组织在脑缺血再灌注后的损伤,其机制可能是通过调控PI3K/AKT通路抑制病理性过表达发挥作用｡因此,红花黄色素可能是预防脑缺血再灌注损伤的有效药物,对大鼠缺血脑卒中有保护作用｡本研究样本局限于单一物种且未验证长期效应,后续可通过灵长类动物实验结合多组学分析,进一步揭示神经保护通路的协同调控机制｡

参考文献:

[2]吴健隆,张潇,江文.缺血性脑卒中神经保护药物的临床研究进展[J].中国实用神经疾病杂志,2023,26(10):1311-1316.

[9]邹儒毅,关俊宏.缺血预处理对大鼠神经细胞凋亡的影响[J].中国医学工程,2012,20(8):16-18.

[10]牛芬溪,刘悦,刘雅楠,等.羟基红花黄色素A的药理作用及研究进展[J].中国药学杂志,2021,56(17):1372-1377.

[11]汪洁,陈纶华,李涵乔,等.羟基红花黄色素A对缺血再灌注损伤保护机制的研究进展[J].医学综述,2022,28(14):2739-2745.

基金资助:广东省中医药局科研项目(No:20212282);

文章来源:黄安岑,周颖,王韵烨,等.红花黄色素对大鼠脑缺血再灌注损伤及PI3K/AKT通路的影响[J].成都医学院学报,2025,20(03):387-390.