龙利叶SauropusrostratusMiq.为大戟科守宫木属常绿小灌木[1],又名龙脷叶、龙舌叶、龙味叶、牛耳叶[2],全草均可入药,具有清热止咳,润肺化痰之功效,可用于治疗支气管哮喘,上呼吸道炎症[3],为广西民间常用壮药,《中华人民共和国药典》收载品种,药用价值高[4,5,6,7]。现代研究表明,龙利叶的水提液具有较好的抗炎和镇痛作用[8,9,10]。但对龙利叶不同极性溶剂提取物的抗炎作用及其作用机制的研究,目前尚未见有公开报道。为了充分利用龙利叶,更好地将龙利叶开发成临床用制剂,本实验对其不同极性部位提取物的抗炎作用及其作用机制进行了研究,以筛选其抗炎活性部位,探讨其抗炎作用机制,为龙利叶的开发和临床应用提供科学依据。

1、材料与仪器

1.1动物

KM小鼠(SPF级),由广西医科大学提供,许可证编号:SYXK桂2010-0001;SD大鼠(SPF级),由广西医科大学提供,许可证编号:SCXK桂2014-0002。

1.2药物及试剂

龙利叶SauropusrostratusMiq.药材购自广西玉林,经广西一心药业副主任药师马利飞鉴定为大戟科守宫木属龙利叶SauropusRostratusMiq.的干燥叶;醋酸地塞米松片(浙江仙琚制药股份有限公司,批号140819);石油醚(60～90℃)(成都市科龙化工试剂厂,批号:2015020702);乙酸乙酯(成都市科龙化工试剂厂,批号:2015030401);正丁醇(成都市科龙化工试剂厂,批号:2014122501);95%乙醇(成都市科龙化工试剂厂,食品级,批号:2015030301);吐温-80(天津博迪化工股份有限公司,批号:131124);伊文思蓝(上海如吉生物科技发展有限公司;批号:150522);角叉菜胶(上海原叶生物科技有限公司,批号:130804);醋酸(美国SPS公司,批号:J1431030);二甲苯(天津市富宇精细化工有限公司,批号:120915);大鼠前列腺素E2(PGE2)ELISAS试剂盒(武汉华美生物工程有限公司,批号:C5440180176);大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)(武汉华美生物工程有限公司,批号:U27015717);丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号:20160229);NO酶法试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号:20160216)。

1.3仪器

AJ150电子分析天平(瑞士梅特勒);UV1800紫外分光光度计(日本岛津;ELx800酶标仪[美国伯腾(BioTekInstruments)仪器有限公司]。

2、方法

2.1供试品的制备

取龙利叶8250g,晒干,粉碎,加7倍量75%乙醇浸泡7d,渗漉提取,回收溶剂,水浴蒸干得总浸膏3170g,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇萃取,回收溶剂,水浴蒸干,分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和95%乙醇部位浸膏,加入5%吐温-80溶液研磨成混悬液,备用。

2.2龙利叶不同极性部位提取物抗炎作用的研究[14,15,16,17,18]

2.2.1龙利叶不同极性部位提取物对二甲苯所致小鼠耳肿胀及肿胀抑制率的影响

取雄性小鼠,体质量18～22g,随机分组,每组8只,即模型组、阳性组(醋酸地塞米松组)、龙利叶不同极性部位提取物高剂量、中剂量、低剂量组,灌胃给药,阳性组灌胃地塞米松3mg/kg,模型组给予等体积生理盐水,各给药组按0.2mL/10g分别灌胃给药,每天1次,连续给药10d,末次给药45min后,各组于小鼠右耳正反面各均匀涂抹二甲苯10μL/只,左耳做对照,15min后处死小鼠,用8mm打孔器左右耳相同的部位打下圆耳片,精密称重,以同一小鼠两耳片重量之差表示肿胀度,并计算肿胀抑制率。

肿胀度=右耳耳片重-左耳耳片重

肿胀抑制率=(模型对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/模型对照组平均肿胀度×100%

2.2.2龙利叶不同极性部位提取物对角叉菜胶所致小鼠足趾肿胀及肿胀抑制率的影响

取雄性小鼠,体质量18～22g,随机分组,每组8只,即模型组、阳性组(地塞米松组)、龙利叶不同极性部位提取物高剂量、中剂量、低剂量组,灌胃给药,阳性组灌胃地塞米松3mg/kg,模型组给予等体积的生理盐水,各给药组按给药容量0.2mL/10g分别灌胃给药,每天1次,连续给药10d。末次给药1h后,各组每只小鼠右侧足趾皮下注射1%角叉菜胶0.05mL,4h后,沿踝关节切下左侧足和右侧足,称重,计算肿胀度和抑制率。

肿胀度=右侧足趾重-左侧足趾重

肿胀抑制率=(模型对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/模型对照组平均肿胀度×100%

2.2.3龙利叶不同极性部位提取物对醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响

取雄性小鼠,体质量18～22g,随机分组,每组8只,即模型组,阳性组(醋酸地塞米松组)、龙利叶不同极性部位提取物高剂量、中剂量、低剂量组,灌胃给药,阳性组灌胃地塞米松3mg/kg,模型组给予等体积的生理盐水,各给药组按给药容量0.2mL/10g分别灌胃给药,每天1次,连续给药7d。末次给药45min后,各组按照0.1mL/10g体质量尾静脉注射0.5%伊文思蓝,并立即腹腔注射0.2mL0.6%醋酸,15min后脱颈椎处死小鼠,用6mL生理盐水腹腔注射冲洗腹腔,收集腹腔液,以590nm为波长测定OD值。

2.2.4龙利叶不同极性部位提取物对小鼠棉球肉芽肿的影响

制作重量为10mg的棉球,高压灭菌。取雄性小鼠,体质量18～22g,随机分组,每组8只,即模型组、阳性组(醋酸地塞米松组)、龙利叶不同极性部位提取物高剂量、中剂量、低剂量组,将小鼠腹腔注射0.1mL/10g5%水合氯醛麻醉,背部切口,将两个精密称定重量的灭菌棉球,分别植入小鼠两侧腋窝皮下。术后次日灌胃给药,阳性组灌胃地塞米松3mg/kg,模型组给予等体积的生理盐水,各给药组按0.2mL/10g分别灌胃给药,每天1次,连续7d,第7天给药后1h,处死小鼠剥离出肉芽肿棉球,剔除脂肪组织,于60℃烘干6h,精密称重,其重量减去原棉球重量即为肉芽肿胀,比较各组肉芽肿胀质量。

2.3龙利叶抗炎活性部位提取物抗炎作用机制的研究[19,20,21,22,23]

2.3.1龙利叶抗炎活性部位提取物对摘除双侧肾上腺小鼠炎症的影响

(1)对去除双侧肾上腺小鼠耳廓肿胀的影响:

取雄性小鼠,体质量18～22g,在水合氯醛麻醉下摘除小鼠双侧肾上腺,于术后肌注庆大霉素,并用葡萄糖氯化钠溶液代替饮用水饲养数天后,随机分组,每组8只,即模型组(摘除肾上腺)、空白组(未摘除肾上腺)、阳性组(醋酸地塞米松3mg/kg)、龙利叶乙酸乙酯、正丁醇,95%乙醇部位提取物高、低剂量组,灌胃给药,阳性组灌胃地塞米松,模型组和空白组给予等体积的生理盐水,各给药组按0.2mL/10g分别灌胃给药,每天1次,连续给药10d,末次给药45min后,于小鼠右耳正反面各均匀涂抹二甲苯10μL/只,左耳做对照,15min后处死小鼠,用8mm打孔器左右耳相同的部位打下圆耳片,精密称重,以同一小鼠两耳片重量之差表示肿胀度,并计算肿胀抑制率。

(2)对去除双侧肾上腺小鼠腹腔毛细血管通透性的影响:

取雄性小鼠,体质量18～22g,在水合氯醛麻醉下摘除小鼠双侧肾上腺,于术后肌注庆大霉素,并用葡萄糖氯化钠溶液代替饮用水饲养数天后,随机分组,每组8只,即模型组(摘除肾上腺)、空白组(未摘除肾上腺)、阳性组(地塞米松组3mg/kg)、龙利叶乙酸乙酯、正丁醇,95%乙醇部位提取物高、低剂量组,灌胃给药,阳性组灌胃地塞米松,模型组和空白组给予等体积的生理盐水,各给药组按给药容量0.2mL/10g分别灌胃给药,每天1次,连续给药7d。末次给药45min后,空白组尾静脉注射生理盐水,其余各组按照0.1mL/10g体质量尾静脉注射0.5%伊文思蓝,并立即腹腔注射0.2mL0.6%醋酸,15min后脱颈椎处死小鼠,用6mL生理盐水腹腔注射冲洗腹腔,收集腹腔液,以590nm为测定波长测定OD值。

(3)对去除双侧肾上腺小鼠棉球肉芽肿的影响:

取雄性小鼠,体质量18～22g,在水合氯醛麻醉下摘除小鼠双侧肾上腺,于术后肌注庆大霉素,并用葡萄糖氯化钠溶液代替饮用水饲养数天后,随机分组,每组8只,即模型组(摘除肾上腺)、空白组(未摘除肾上腺)、阳性组(醋酸地塞米松3mg/kg)、龙利叶乙酸乙酯、正丁醇,95%乙醇部位提取物高、低剂量组,灌胃给药,阳性组灌胃地塞米松,模型组和空白组给予等体积的生理盐水,各给药组按0.2mL/10g分别灌胃给药,每天1次,连续7d,第7天给药后1h,处死小鼠,剥离出肉芽肿棉球,剔除脂肪组织,于60℃烘干6h,精密称重,其重量减去原棉球重量即为肉芽肿胀,比较各组肉芽肿胀质量。

2.3.2龙利叶抗炎活性部位提取物对角叉菜胶致大鼠急性胸膜炎的影响

(1)造模方法:

取雄性大鼠,体质量180～220g,随机分组,每组8只,即空白组、模型组、阳性组(醋酸地塞米松2.1mg/kg)、龙利叶乙酸乙酯、正丁醇,95%乙醇部位提取物高剂量组,灌胃给药,阳性组灌胃地塞米松,空白组和模型组给予等体积生理盐水,连续给药10d,末次给药后,模型组及各给药组动物,分别于胸腔内注射0.1mL2%角叉菜胶,造成大鼠急性胸膜炎动物模型,空白组注入等体积生理盐水,致炎6h后,处死动物,用微量移液器将胸腔内全部渗出液吸出,再用1mL冰生理盐水冲洗胸腔,将吸出和冲洗得到的胸腔液合并,并移至离心管内(冰浴),离心,取上清液贮存于-80℃,待测。

(2)检测指标与方法:

取“(1)”项下的胸腔渗液的上清液,采用ELISA双抗夹心法,分别按照PGE2试剂盒、TNF-α试剂盒、MDA(TBA法)试剂盒、NO酶法试剂盒说明分别测定PGE2、TNF-α、MDA、NO的含量。

2.4统计学分析

采用SPSS18.0软件进行统计分析,实验数据以x¯±sx¯±s表示,统计分析采用t检验,比较模型组与空白组(正常对照组)之间、给药组与模型组之间的差异,以P<0.05为差异有统计学意义。

3、结果

3.1龙利叶不同极性提取物对二甲苯所致小鼠耳肿胀及肿胀抑制率的影响

与模型组比较,龙利叶石油醚部位提取物组的耳肿胀度变化不明显,没有显著性差异(P>0.05),龙利叶乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇部位提取物组的耳肿胀度明显减小,有显著性差异(P<0.05或P<0.01),龙利叶乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇提取物对二甲苯所致小鼠耳肿胀有抑制作用,结果见表1～表4。

表1龙利叶石油醚部位对二甲苯所致小鼠耳肿胀及肿胀抑制率的影响

表2龙利叶乙酸乙酯部位对小鼠耳肿胀及肿胀抑制率的影响

3.2龙利叶不同极性提取物对角叉菜胶所致小鼠足趾肿胀及肿胀抑制率的影响

与模型组比较,龙利叶石油醚部位提取物组的足趾肿胀度减小不明显,没有显著性差异(P>0.05),乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇部位提取物组足趾肿胀度明显减小,有显著性差异(P<0.05或P<0.01),龙利叶乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇部位提取物能降低角叉菜胶所致小鼠足肿胀,结果见表5～表8。

3.3对醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响

与模型组比较,龙利叶石油醚部位提取物组不能明显降低醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性(P>0.05),乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇部位提取物组腹腔毛细血管通透性明显降低,有显著差异(P<0.05或P<0.01),结果见表9～表12。

表3龙利叶正丁醇部位对小鼠耳肿胀及肿胀抑制率的影响

表4龙利叶95%乙醇部位对二甲苯所致小鼠耳肿胀及肿胀抑制率的影响

表5龙利叶石油醚部位浸膏对角叉菜胶所致小鼠足肿胀及肿胀抑制率的影响

表6龙利叶乙酸乙酯部位浸膏对角叉菜胶所致小鼠足肿胀及肿胀抑制率的影响

表7龙利叶正丁醇部位浸膏对角叉菜胶所致小鼠足肿胀及肿胀抑制率的影响

表8龙利叶95%乙醇部位浸膏对角叉菜胶所致小鼠足肿胀及肿胀抑制率的影响

表9龙利叶石油醚部位浸膏对醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响

表10龙利叶乙酸乙酯部位浸膏对醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响

表11龙利叶正丁醇部位浸膏对醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响

表12龙利叶95%乙醇部位浸膏对醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响

3.4对小鼠棉球肉芽肿的影响

与模型组比较,龙利叶石油醚部位提取物不能明显降低棉球肉芽肿(P>0.05),乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇部位提取物能降低小鼠棉球肉芽肿,结果见表13～表16。

表13龙利叶石油醚部位浸膏对小鼠棉球肉芽肿的影响

表14龙利叶乙酸乙酯部位浸膏对小鼠棉球肉芽肿的影响

表15龙利叶正丁醇部位浸膏对小鼠棉球肉芽肿的影响

表16龙利叶95%乙醇部位浸膏对小鼠棉球肉芽肿的影响

3.5对二甲苯所致去除双侧肾上腺小鼠耳肿胀及肿胀抑制率的影响

与模型组比较,龙利叶乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇部位提取物对去除双侧肾上腺小鼠耳廓肿胀有抑制作用,有显著性差异(P<0.05或P<0.01),结果见表17。

3.6对去除双侧肾上腺小鼠棉球肉芽肿的影响

与模型组比较,龙利叶乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇部位提取物对去除双侧肾上腺小鼠棉球肉芽肿有抑制作用(P<0.05),结果见表18。

3.7对急性胸膜炎大鼠PGE2、TNF-α、MDA、NO的影响

与模型组比较,龙利叶乙酸乙酯部位提取物组的PGE2、TNF-α的含量明显减少(P<0.01),MDA、NO含量变化不大,无显著性差异(P>0.05),正丁醇部位提取物组PGE2、TNF-α、NO含量明显减少,有显著性差异(P<0.01),MDA含量变化不大,无显著性差异(P>0.05),95%乙醇部位提取物组的PGE2、TNF-α、TNF-α、NO的含量明显减少,有显著性差异(P<0.01),结果见表19。

表17对去除双侧肾上腺小鼠醋酸所致其腹腔毛细血管通透性的影响

表18对去除双侧肾上腺小鼠棉球肉芽肿的影响

表19对急性胸膜炎大鼠PGE2、TNF-α、MDA、NO的影响

4、讨论

炎症是生物组织受到外伤、出血、或病原感染等刺激,激发的生理反应。其中包括了红肿、发热、疼痛等症状,是致炎因子对机体的损害作用所诱发的以防御为主的局部组织反应。主要表现为组织的变质、渗出和组织细胞增生[21]。地塞米松为目前临床公认的具有良好抗炎作用的药物,因此,为了更科学地对比研究龙利叶的抗炎作用,本实验以地塞米松作为阳性对照药,分别采用二甲苯致小鼠耳廓肿胀、角叉菜胶致小鼠足趾肿胀、醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性的急性炎症模型和小鼠棉球肉芽肿慢性模型研究龙利叶的抗炎作用;研究表明,龙利叶的乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇部位提取物能降低二甲苯所致小鼠耳肿胀程度和角叉菜胶致小鼠足趾肿胀,降低醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性,对急性、早期炎症具有很好的抗炎作用,龙利叶的乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇部位提取物亦能降低小鼠棉球肉芽肿的湿重,对炎症晚期(慢性炎症)也有一定的抑制作用。

神经内分泌免疫网络系统是机体重要的炎症调节系统,下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴不仅是机体应激反应时的主要整合中枢,也是神经内分泌免疫网络系统调节炎症反应的主要途径[24]。本实验去除了小鼠双侧的肾上腺,分别采用耳廓肿胀、足趾肿胀、腹腔毛细血管通透性的急性炎症模型和棉球肉芽肿慢性探讨龙利叶的抗炎作用机制是有与下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴有关,研究结果表明:龙利叶乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇部位提取物的抗炎机制与下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴无关。

胸膜炎为渗出性炎症,角叉菜胶诱导的大鼠胸膜炎是一种理想的急性炎症模型,液体外渗,白细胞迁移,渗出液中很容易检测与炎症反应有关的不同生化参数。因此本实验选择角叉菜胶诱导的大鼠胸膜炎模型对其抗炎作用机制进行研究。

PGE2是花生四烯酸的代谢产物,是炎症反应的重要介质,具有扩张血管、致热、致痛等生物活性,并可通过加强组胺及缓激肽的效应而引起血管通透性增强、加强其他趋化因子的作用而使白细胞向炎区聚集,从而引起水肿、充血、局部红斑等炎症反应症状[21,22]。NO是另一重要致炎分子,能导致病理性血管扩张、组织损伤、炎症反应等[25,26]。TNF-α、IL-1β亦是重要的炎症细胞因子,均可促进炎症反应和组织损伤,二者可诱导机体产生急性时相反应蛋白,并可作用于血管内皮细胞,使之分泌趋化性细胞因子,从而趋化单核细胞及中性粒细胞,并刺激其活化,释放出多种炎症介质,引起炎症反应[21,22]。因而,能够抑制生物体PGE2、NO、TNF-α等炎症细胞因子产生的药物,均具有一定的抗炎作用。生物体内,自由基作用于脂质发生过氧化反应,氧化终产物为丙二醛(MDA),会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合,且具有细胞毒性,有资料显示[21,22]活性氧自由基的增多,可能是炎症的病理机制之一。本实验研究表明,龙利叶正丁醇和95%乙醇提取物能明显抑制角叉菜胶诱导的急性胸膜炎大鼠胸腔液的PGE2、NO、TNF-α的异常升高,但未能减少MDA含量,提示其抗炎作用机制主要与抑制致炎介质PGE2,促炎细胞因子NO、TNF-α的生成有关,龙利叶的乙酸乙酯提取物能明显抑制角叉菜胶诱导的急性胸膜炎大鼠胸腔液的PGE2、TNF-α的异常升高,但未能减少MDA含量,提示其抗炎作用机制主要与抑制致炎介质PGE2和TNF-α的生成有关。

参考文献：

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部[S].北京:中国医药出版社,2015:97.

[2]南京中医药大学.中药大辞典上册[M].2版.上海:上海科学技术出版社,2006:876.

[3]国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草第四册[M].上海:上海科学技术出版社,2006:855.

[4]《全国中草药汇编》编写组.全国中草药汇编下册[M].2版.北京:人民卫生出版社,2006:169.

[5]广西壮族自治区革命委员会卫生局.广西本草选读下册[M].北京:人民卫生出版社,1974:1590.

[6]肖培根.中国本草图录一卷[M].北京:人民卫生出版社,1989:102.

[7]中国科学院植物研究所.中国植物志[M].北京:中国科学院植物所,2005:167.

[8]丘琴,甄汉深,王莹,等.龙利叶根急性毒性和抗炎作用的研究[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(2):286-288.

[9]丘琴,黄培倩,甄汉深,等.龙利叶茎急性毒性和抗炎作用的研究[J].时珍国医国药,2016,27(3):541-542.

[10]甄汉深,刘蓉,丘琴,等.龙利叶抗炎镇痛作用的研究[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(9):270-273.

[11]陈奇.中药药理研究方法学[M].3版.北京:人民卫生出版社,2011:109-116.

[12]魏伟.药理实验方法学[M].北京:人民卫生出版社,2010:383-393.

[13]徐淑云,卞如濂,陈修.药理实验方法学[M].3版.北京:人民卫生出版社,2002:927-930.

[14]黄显章,丁生晨,袁林,等.蜣螂乙醇提取物的抗炎作用研究[J].中华中医药学刊,2017,35(4):1002-1004.

[15]吴凤荣,曾聪彦,戴卫波,等.宽筋藤水提液镇痛抗炎作用的实验研究[J].中华中医药学刊,2016,34(7):1775-1777.

[16]王钰乐,刘文,杨道斌,等.黄芩的谱效关系研究[J].中华中医药学刊,2017,25(12):3110-3113.

[17]林梦雅,张玉萍,李雅,等.基于灰色关联度分析的丹参提取物抗炎作用谱效关系研究[J].中草药,2017,48(16):3447-3452.

[18]李姗姗,朱英.中药活性成分抗炎作用的研究进展[J].中华中医药学刊,2012,30(1):143-146.

[19]白关亚,何盼,李媛媛,等.青翘不同极性部位抗炎作用的谱效关系分析[J].中国实验方剂学杂志,2017,23(11):1-6.

[20]魏春华,程虹毓,朱继孝.中药解热镇痛抗炎作用机制研究进展[J].中医药通报,2016,15(4):59-63.

[21]黄滨,雷小勇.中药抗炎作用发挥途径及作用机制研究进展[J].临床合理用药杂志,2015,8(11):177-179.

[22]刘萍.中药抗炎作用发挥途径及机理综述[J].中医临床研究,2015,7(14):147-148.

[23]余昕,欧丽兰,钟志容,等.坚龙胆抗炎活性部位筛选及抗炎机制探讨[J].中国实验方剂学杂志,2015,21(6):160-164.

[24]陈龙.下丘脑-垂体-肾上腺轴及其调节[J].国外医学·内分泌学分册,1997,17(3):137-140.

[25]陈敏珠.一氧化氮与炎症免疫细胞[J].中国药理学通报,1992,8(6):409-415.

[26]王筱婧,左艳敏,王东兴,等.一氧化氮介导的中药及其活性成分的抗炎作用研究进展[J].免疫学杂志,2015,31(5):435-440.

丘琴,刘玉雯,甄汉深,范秀春,甄丹丹.龙利叶抗炎活性部位筛选及其作用机制的研究[J].中华中医药学刊,2020,38(04):37-42.

基金:国家自然科学基金(81460601);广西壮族自治区卫生厅中医药科技专项(GZZJ13-03);广西壮瑶药协同创新中心项目(桂教科研[2013]20);广西壮瑶药重点实验室项目(桂科基字[2014]32);广西重点学科壮药学项目(桂教科研[2013]16);广西八桂学者中药创新理论与药效研究项目(J13162).